大幅度提高馬齒莧組培效率的培養環境條件優化

楊顏顏，云晶晶，杜建梅，楊心怡，王新風，陸長梅*（.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京003；.江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，淮陰師范學院，江蘇淮安3300）

大幅度提高馬齒莧組培效率的培養環境條件優化

楊顏顏1，云晶晶1，杜建梅1，楊心怡1，王新風2，陸長梅1*
（1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210023；2.江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室，淮陰師范學院，江蘇淮安223300）

為了提高馬齒莧的組培效率，解決馬齒莧出愈時間遲、愈傷組織誘導率不高、愈傷組織誘導需要使用2，4-D、不定芽增殖來源有限等問題，根據馬齒莧的最適生長條件，將組織培養環境調整為溫度（30依1）益、全光照，并從無菌苗上直接取材進行外植體培養。結果表明：種子在高溫、全光照條件下萌發快，且無菌苗長勢好。取材于無菌苗上的根、莖和葉均可以在不添加2，4-D的MS培養基中脫分化形成愈傷組織，且莖在MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培養基中、葉在MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L培養基中的初始出愈時間均提前至4 d，且誘導率均達到100%，愈傷組織長勢旺盛。帶腋芽的莖段在MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培養基中可以直接分化出大量不定芽，增殖率達10.5。在最適光溫環境下，馬齒莧外植體出愈迅速，愈傷組織誘導率和不定芽增殖率大幅度提高。

馬齒莧；高溫；全光照；愈傷組織誘導；不定芽分化

馬齒莧（Portulaca oleracea）為馬齒莧科（Portu原lacease）馬齒莧屬（Portulaca）的1 a生肉質草本植物。其蛋白質含量高、氨基酸種類齊全、總黃酮含量豐富，還含有棕-3不飽和脂肪酸、鉀素、去甲腎上腺素、褪黑激素等多種保健營養成分，具有改善血液循環、提高人體免疫力、防治心血管疾病、抑制微生物生長等多重功效[1耀3]。此外，馬齒莧耐高溫、干旱、高濕、高鹽以及重金屬污染等逆境的能力強大，又是非常好的生態修復植物[4]。馬齒莧集保健、食用、藥用、生態價值于一身，值得進一步研究與開發[5]。

20世紀90年代以來，國內外對馬齒莧的研究集中在生藥學及其所含的化學成分、生物活性物質、臨床應用、多種保健食品的加工等方面[6耀11]。但是，如何利用現代生物技術對馬齒莧進行有效的遺傳改良并挖掘其潛在的利用價值尚少見報道[12]。王瑞聰等[13]曾利用化學誘變的方法進行馬齒莧遺傳改良，試圖擴大種質資源。自2003年開始，國內多名學者[14耀16]對馬齒莧的組織培養技術進行了研究，希望為馬齒莧的遺傳改良奠定基礎。但綜合分析現有的馬齒莧組織培養技術，發現尚存在一些問題，如，愈傷組織誘導率不高，愈傷組織誘導多采用2，4-D導致后續不定芽分化相對較困難；外植體來源狹窄，主要是葉片；不定芽僅可以從愈傷組織誘導，周期較長等[14耀18]。為了更好地發展馬齒莧資源特色，提高馬齒莧的組織培養效率，我們從改變培養條件與培養馬齒莧無菌苗入手，在擴大外植體來源、減少2，4-D使用量、增加不定芽來源渠道等方面，對馬齒莧的快繁和再生技術進行了探索，以期為馬齒莧的遺傳改良、規模化繁殖和醫藥保健品原材料生產等研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為野生型馬齒莧種子，2013年9月下旬采自南京師范大學仙林校區植物園（東經118毅95憶、北緯32毅15憶）。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗獲得馬齒莧干種子流水沖洗30 min—75%酒精浸泡30耀60 s—無菌水沖洗1次—0.1%的HgCl2溶液浸泡8 min—無菌水沖洗4次—吸干表面水分，然后接種到1/2MS培養基（蔗糖3%、瓊脂0.9%、pH值5.8，下同）上，在溫度（30依1）益、光照強度2 000耀3 000 lx、全光照條件下進行培養。記錄種子萌發以及幼苗長至1 cm左右和長出4片真葉時所需的時間。

1.2.2愈傷組織誘導選擇長出4片真葉的馬齒莧無菌苗，分別以其葉片、下胚軸、根作為外植體，接種到MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培養基中。接種后觀察最早出愈時間和愈傷組織長勢，第21 d時統計愈傷組織誘導率。分析不同器官產生愈傷組織能力的差異。

選擇最佳外植體器官，分別接種到不同激素濃度配比的MS培養基中，試驗激素濃度設NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L計4個處理，每處理接種80個。接種后第21 d，統計愈傷組織誘導率，觀察愈傷組織長勢。篩選最佳愈傷組織培養基配方。

為了擴大用于愈傷組織誘導的外植體來源，進一步擴大激素濃度配比，試驗NAA和6-BA濃度均設0、0.5、1.0、1.5 mg/L，將2種激素按照配比配制成系列濃度處理的培養基，接種馬齒莧葉片。觀察馬齒莧葉片在不同培養基中愈傷組織的誘導狀況。

1.2.3不定芽增殖選擇生長旺盛的愈傷組織，接種到MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培養基中[17]，進行不定芽增殖，接種后第21 d觀察外植體狀態，統計不定芽增殖率。同時，選擇生長21 d以上、節間展開的無菌苗，除去根系，保留植株的腋芽或頂芽，將長0.5 cm左右的外植體接種到不同激素濃度配比的培養基中，試驗激素濃度設NAA 0.2 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L垣6-BA 6.0 mg/L計4個處理，每處理接種40個，接種后第21 d統計不定芽增殖率。分析不定芽在不同培養基中的增殖誘導情況。

1.2.4生根誘導將長度躍0.5 cm的不定芽，分別接種到MS垣NAA 0.0 mg/L、1/2MS垣NAA 0.0 mg/L、1/2MS垣NAA 0.5 mg/L、1/2MS垣NAA 1.0 mg/L培養基中，進行生根誘導。接種后第7 d，觀察不定根長勢，統計不定根誘導率。

2　結果與分析

2.1無菌苗獲得

馬齒莧播種后2耀3 d，開始有種子萌發；播種后7 d，無菌苗長至1 cm左右；播種后21 d時，多數幼苗長出4片真葉。

2.2愈傷組織誘導

2.2.1不同器官外植體對愈傷組織誘導的影響不同器官誘導產生愈傷組織的能力不同（表1）。接種后第4 d，下胚軸首先開始在兩端膨大，并呈嫩綠色；接種后第7 d，葉片傷口處開始長出嫩綠色愈傷組織；接種后第10 d時，根兩端開始長出嫩綠色愈傷組織。下胚軸不僅愈傷組織出現早，而且愈傷組織誘導率最高（100%），長勢也最旺盛；葉片的愈傷組織誘導率次之；根的愈傷組織誘導率雖然最低，但也達到了89.3%，這與李燾等“胚根不能形成愈傷組織”的結論[14]截然不同。可以看出，馬齒莧幼苗的葉片、下胚軸和根均可以作為外植體用來誘導形成愈傷組織，其中，用下胚軸誘導產生愈傷組織最快、生長最好。

表1　不同器官外植體對愈傷組織誘導的影響Table1　Effect of explants from different organs on the callus induction

表2　不同激素濃度配比對下胚軸愈傷組織誘導的影響Table2　Effects of different hormone combinations on the callus induction of hypocotyls

選擇下胚軸作為外植體，接種到不同激素濃度配比配制的培養基中，以優化下胚軸誘導愈傷組織的培養基配方。結果（表2）顯示，在4種培養基中，下胚軸均可以于接種后4 d左右誘導出愈傷組織，且誘導率均達到了100豫，但其后期的愈傷組織長勢差異很大。在NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L和NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L處理的培養基中，淺綠色愈傷組織生長均旺盛，其中，NAA0.5mg/L垣6-BA0.5mg/L處理的愈傷組織上有少量不定芽形成；而NAA1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L處理的淺綠色愈傷組織表面長出淺白色愈傷組織，但不定芽較少出現。在NAA 1.0 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L和NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L處理的培養基中，愈傷組織長勢均相對較弱，其中，NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L處理的少數愈傷組織上長出了毛狀根，這可能是NAA濃度偏高所致。

為了擴大愈傷組織誘導所用的外植體來源，以馬齒莧葉片為外植體，進一步擴大培養基激素濃度進行配比，觀察愈傷組織在不同培養基中的誘導狀況。結果（表3）顯示，在不添加激素的培養基中，葉片不能形成愈傷組織；在單一添加NAA處理的培養基中，葉片出愈時間延遲至9 d，愈傷組織呈淡黃色且生長緩慢，誘導率隨NAA濃度的升高而升高；在單一添加6-BA處理的培養基中，葉片出愈時間為7 d，愈傷組織呈淡綠色且生長依然緩慢，誘導率隨6-BA濃度的升高而逐漸降低；在同時添加NAA和6-BA的MS培養基中，葉片愈傷組織呈綠色且生長旺盛，其中，NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L處理不僅出愈時間提早至4 d，而且誘導率也均達到了100%。

2.3不定芽增殖

將下胚軸和葉片來源的生長旺盛的愈傷組織接種到MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培養基中誘導形成不定芽，增殖系數為10.2，與文獻報導的較高的增殖系數[18]相當。這里不再贅述。

為增加不定芽來源，將帶有腋芽的馬齒莧莖段轉接到不同激素濃度配比的培養基中進行不定芽增殖誘導，結果（表4）顯示，帶有腋芽的莖段在NAA 0.2 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培養基中沒有不定芽增殖，但是莖伸長、增粗，其中直立扦插莖伸長和增粗顯著；在NAA 0.2 mg/L垣6-BA 6.0 mg/L培養基中，有大量不能正常長大的不定芽形成；在NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培養基中，不定芽可以正常長大，增殖率達到10.5。表明將帶有腋芽的莖段扦插到不同激素濃度配比的培養基中可以分別進行壯苗和不定芽的增殖，其中，MS垣NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0耀5.0 mg/L培養基適合于不定芽的壯苗培養，MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培養基適合于不定芽的增殖。

2.4生根誘導

剪取長1 cm以上的不定芽，轉接到不同的培養基中進行不定根誘導，結果（表5）顯示，接種后第7 d，所有不定芽基部均長出不定根，其中，在不添加NAA的2種培養基中，不定根均可迅速長出，但數量少、根較細，且在1MS培養基中的生根數更少；在1/2MS培養基中，NAA添加濃度為0.5 mg/L時不定根數量中等且較粗壯，而NAA濃度增加到1.0 mg/L時不定根短小密集。可以看出，在試驗的4種培養基中，1/2MS垣NAA 0.5 mg/L培養基最適合于馬齒莧不定根的誘導。待幼苗長至3 cm以上時，常規煉苗移栽，成活率均能達到99%以上。

表3　不同激素濃度配比對葉片愈傷組織誘導的影響Table3　Effects of different hormone combinations on the callus induction of leaves

表4　不同激素濃度配比對莖段不定芽增殖的影響Table4　Effects of different hormone combinations on the on the adventitious buds proliferation from stems

表5　不同培養基組成對不定根誘導的影響Table5　Effects of different components of culture medium on the adventitious root induction

3　結論與討論

3.1組培環境條件調整

現有馬齒莧組織培養相關文獻中的外植體來源有2種：一種是直接取材田間生長的植株[16，18，19]，另一種是利用種子做外植體獲得無菌苗[14，15，17]。可能是由于田間采集的外植體不夠幼嫩以及外植體需要徹底消毒從而影響外植體活性等緣故，導致田間取材的馬齒莧外植體普遍出愈時間遲、出愈率不高[16，20，21]。而從無菌苗上取材時，雖然消除了消毒劑的影響，但仍需要使用2，4-D才能將愈傷誘導率在個別培養基上達到100%[17]。而2，4-D的使用對后續不定芽的分化極為不利。如何進一步提高愈傷組織誘導率和不定芽分化率是提高馬齒莧組織培養效率的關鍵所在。

馬齒莧屬于C4兼性CAM植物，其僅在30益以上時萌發迅速、高光強全光照條件下生長旺盛[17，20]。李貞霞等[21]的研究也顯示，馬齒莧在30益時愈傷組織長勢旺盛。而現有文獻報道的組培條件多數是溫度25益、光照時間16h。是否是因為環境溫度和光照條件的不適合而導致組培效率不高？鑒于此，我們將培養環境條件調整為溫度（30依1）益、全光照，并且從無菌苗的培養入手，進行馬齒莧的快繁和再生體系建立研究。無菌苗階段的研究結果顯示，該條件下，播種7 d后，馬齒莧無菌苗就能長至1 cm，可以進行外植體取材。

3.2愈傷組織誘導

以溫度（30依1）益、全光照下生長的馬齒莧無菌苗的各個器官作為外植體，接種到MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L培養基中。在不使用2，4-D、不改變其他培養條件下，下胚軸的出愈時間提早至4 d，較劉紅梅等[17]應用2，4-D的下胚軸出愈時間提早了4 d，愈傷誘導率也提高到100%；其次，葉片的愈傷誘導率雖然沒有達到100%，但也達到了98%，較前人的研究結果大大提高，而且在培養基優化為MS垣NAA1.5mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L后初始出愈時間亦提早至4 d、誘導率也提高到100%；第三，尚無文獻顯示馬齒莧根可以誘導出愈傷組織，但在本研究中，馬齒莧根的愈傷誘導率也達到了89.3%，只是出愈時間較晚、愈傷組織長勢較慢。

目前，絕大多數植物組織培養的光溫條件控制在光照時間16 h、溫度（25依1）益。誠然，多數植物比較適應這個條件，但本研究結果提示，對一些目前組培效率尚不高的植物，也許從該植物自然生長時的最佳生長條件考慮，可能就會得到意想不到的結果。

3.3不定芽誘導

組織培養中獲得不定芽的常見途徑有2種：一種是外植體先經脫分化形成愈傷組織，再經再分化形成不定芽；另一種是外植體直接形成不定芽。其中，第2種方式由于缺少了易導致變異的愈傷組織誘導和形成階段，不僅試驗成本和時間大為縮短，而且對于需要保持母本遺傳性狀的快繁和再生體系建立極為有利。鑒于現有馬齒莧組培研究中不定芽的增殖均是基于愈傷組織誘導后再分化形成[18]，于是，作者利用帶有腋芽的莖段探討能否直接形成不定芽。結果顯示，由腋芽直接增殖不定芽是可行的，而且利用MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培養基可以直接在較短的時間內將增殖率達到10以上。雖然這一增殖率尚較文獻報道的愈傷組織再生芽的最高增殖率為13.4和12.5[17，19]略低，但由于大大縮短了試驗進程，越過了變異易發階段，因此，在實際應用中應有更大的利用價值。

綜上所述，確定馬齒莧的最佳組織培養條件是：組織培養環境條件為溫度（30依1）益、全光照；首先在1/2MS培養基中常規接種培養無菌苗；7 d后，無菌苗的根、莖、葉均可用于愈傷組織誘導；莖在MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 0.5 mg/L培養基中、葉片在MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5耀1.5 mg/L培養基中的最早出愈時間均為4 d，愈傷誘導率均為100%，且愈傷組織長勢旺盛；愈傷組織在MS垣NAA 0.5 mg/L垣6-BA 4.0 mg/L培養基中可誘導形成不定芽；帶頂芽或腋芽莖段在MS垣NAA 0.2 mg/L垣6-BA 4.0耀5.0 mg/L培養基中進行壯苗培養，在MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L培養基中進行不定芽增殖，不定芽增殖率可達10.5；待不定芽長至1 cm以上時，在1/2MS垣NAA 0.5 mg/L培養基中進行生根誘導，生根率可達到100%，且不定根數量多、粗壯。馬齒莧愈傷組織誘導和不定芽增殖快速增加的原因，可能與高溫、全光照條件更適合馬齒莧的生長有關。深層次原因尚待進一步探討。

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Optimization of Culture Conditions for Greatly Improving the Tissue Culture Efficiency of Purslane

YANG Yan-yan1，YUN Jing-jing1，DU Jian-mei1，YANG Xin-yi1，WANG Xin-feng2，LU Chang-mei1*
（1.College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake，Huaiyin Normal University，Huaian 223300，China）

In order to improve the tissue culture efficiency of purslane，the problems，such as late callus formation，low rate of callus induction，requiring the use of 2，4-D in callus induction，and limited source of explants for adventitious buds proliferation etc.should be solved.According to the optimal growth conditions for purslane，its tissue culture environment was adjusted to（30依1）益of temperature and full light exposure，and explants were taken directly from the sterile seedlings.The results showed that seeds germinated well and aseptic seedlings grew fast under this condition.Callus could be induced from each organ of aseptic seedlings on MS垣NAA 1.0 mg/L垣6-BA 1.0 mg/L medium without the addition of 2，4-D.Callus could be first found on the stems in 4 d and the callus grew very fast.After further adjust原ment for hormones，callus could be induced a hundred percent in 4 d from leaves on MS垣NAA 1.5 mg/L垣6-BA 0.5-1.5 mg/L medium.A large number of adventitious buds could be induced from stems with axillary buds on MS垣NAA 0.1 mg/L垣6-BA 5.0 mg/L medium with a proliferation rate of 10.5.Under the optimum temperatureandlightenvironment，callusfrom purslane explants could be induced early.The cal原lus grew fast，and its induction rate together with proliferation rate of adventitious buds were higher.

Purslane；High temperature；Full light exposure；Callus induction；Bud differentiation

Q647

A

1008-1631（2016）02-0043-05

2015-06-24

國家基礎科學人才培養基金項目（J1103507）；國家基礎科學人才培養基金項目（J1210025）；江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室開放課題(HZHL1504)；江蘇省大學生創新項目

楊顏顏(1990-)，女，山東泰安人，碩士研究生在讀，主要從事植物資源與環境相關研究。E-mail：1370636774@qq.com。

陸長梅（1969-），女，江蘇海安人，副教授，博士，主要從事植物資源與環境相關的教學和研究工作。E-mail：luchangmei@njnu.edu.cn。