小麥SRAP-PCR反應程序的優化及引物篩選

張彥波，肖　磊，張文娟，張清華，董　策，張希太（.邯鄲市農業科學院，河北邯鄲05600；.邯鄲市農業局，河北邯鄲05600）

小麥SRAP-PCR反應程序的優化及引物篩選

張彥波1，肖磊1，張文娟2，張清華1，董策1，張希太1
（1.邯鄲市農業科學院，河北邯鄲056001；2.邯鄲市農業局，河北邯鄲056002）

為建立最佳的小麥SRAP-PCR反應體系，進一步對小麥品種進行遺傳多樣性分析，采用L9（34）正交試驗設計，對小麥SRAP-PCR程序中的變性時間、復性時間、延伸時間以及后35個循環的復性溫度進行了優化試驗。結果表明：當小麥SRAP-PCR擴增程序以變性30 s、復性60 s、延伸60 s，后35個循環復性溫度55益時，擴增效果最好。應用該體系從65對SRAP引物組合中篩選出擴增條帶清晰、多態性豐富的23對引物組合，驗證了該體系具有穩定性和可靠性，可進一步用于小麥的分子標記、輔助育種與遺傳分析研究。

小麥；SRAP-PCR反應程序；條件優化；引物篩選

序列相關擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是繼RAPD和SSR以后出現的新型分子標記技術，由美國加州大學蔬菜系的Li和Quiros博士于2001年提出[1]。通過設計獨特的雙引物，對基因的ORFs（Open reading frames）特定區域進行擴增，其中，上游引物長17 bp，對外顯子區域進行特異擴增；下游引物長18 bp，對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增。因不同個體以及物種的內含子、啟動子與間隔區長度不同而產生多態性。該標記具有簡便、高效、產率高、高共顯性、重復性好、易測序、便于克隆目標片段的特點，目前已成功地應用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、重要性狀標記以及相關基因克隆等方面[2，3]。

SRAP-PCR反應程序采用復性變溫法擴增，最初Li等[1]設計的程序為94益預變性5 min；94益變性60 s，35益復性60 s，72益延伸60 s，5個循環；94益變性60 s，50益復性60 s，72益延伸60 s，30耀35個循環；72益延伸5 min，4益保存。隨著在不同物種上的應用，該程序相應地有了不同的調整。SRAP分子標記技術在小麥研究中已有初步應用[4耀6]，但針對小麥中SRAP-PCR反應程序的優化尚未見報道，小麥最佳的擴增程序有待確定。作者對小麥SRAP-PCR反應程序進行優化，并篩選出適合于小麥的引物組合，旨為進一步小麥分子標記、輔助育種與遺傳分析研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

小麥（Triticum aestivum L.）品種為衡5229，由河北省農林科學院旱作農業研究所提供。SRAP引物18條（正向引物5條，反向引物13條）[8耀10]（表1），由上海生工生物公司合成。使用英國TECHNE公司生產的TC-5000 PCR儀進行SRAP-PCR反應。

表1　SRAP引物序列Table1　Primer sequence used for SRAP analysis

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取與引物組合取小麥葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，電泳檢測其質量與純度，濃度稀釋至10 mg/L。

1.2.2PCR反應體系設計20滋L的反應體系：10伊Buffer 2滋L，Mg2+2 mmol/L，Taq聚合酶2 U，dNTPs 0.2 mmol/L，模板DNA約40 ng，引物0.6滋mol/L，無菌超純水補足20 mL[7]。

1.2.3PCR擴增程序正交試驗設計及產物的檢測基于統計學原理，采用L9（34）正交試驗設計，其中4個因素分別為變性時間、復性時間、延伸時間和復性溫度（前5個循環復性溫度35益不變），每因素均設3個水平（表2）。PCR反應程序：94益預變性5 min；94益變性、35益復性和72益延伸，各階段時間按照試驗設計進行，共5個循環；94益變性、復性和72益延伸，各階段時間和復性溫度按照試驗設計進行，共35個循環；72益延伸5 min，4益保存。采用引物組合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2，以上述PCR反應程序設定進行PCR擴增，每對引物均設3次重復。PCR擴增產物采用6豫的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，每泳道上樣量為8滋L，在200V恒電壓下電泳2.5h，剝膠，銀染，照相，進行擴增條帶的分析。

表2　SRAP-PCR的L9（34）正交試驗設計Table2　Orthogonal design for SRAP-PCR［L9（34）］

1.2.4引物篩選及優化體系的驗證將正向引物與反向引物隨機組合的65對引物，按照優化后的擴增程序進行PCR檢測，篩選出擴增條帶清晰且多態性豐富的引物；并將這些引物再次按照優化后的擴增程序進行PCR，以驗證優化體系的穩定性。

圖1　SRAP-PCR擴增程序正交試驗設計電泳結果Fig.1 The electrophoresis results of SRAP-PCR program by orthogonal design

2　結果與分析

2.1SRAP-PCR擴增程序正交試驗設計的電泳結果分析

對擴增結果進行直觀分析，依據擴增條帶的數量、亮度和清晰度評分，9個試驗結果最高為9分、最低為1分。3對引物組合Me1/Em2、Me1/Em7和Me2/Em2在擴增條帶數量、擴增片段大小以及清晰度上有顯著區別（圖1），其中，Me1/Em2引物組合1耀9泳道擴增條帶評分依次為1、8、9、1、1、1、1、1、1；引物組合Me1/Em7和Me2/Em2在擴增結果上有很大的相似性，1、2、3泳道上均有條帶出現，且1耀9泳道評分相同，依次為7、8、9、1、1、1、1、1、1，其中均以3泳道評分最高。表明引物組合Me1/Em2在復性時間和延伸時間較長的情況下才能擴增出條帶，并且復性時間和延伸時間同時達到最長60 s時，擴增結果最好；引物組合Me1/Em7和Me2/Em2進行條帶擴增的3個復性溫度對結果沒有絕對影響，而在變性時間均為30 s的情況下，復性時間和延伸時間同樣都是達到60 s時評分最高。綜合分析得出，SRAP-PCR擴增變性30 s、復性60 s、延伸60 s，后35個循環復性溫度55益時，擴增效果最好。

2.2引物的篩選及SRAP-PCR擴增程序的驗證

依據正交試驗得出的最佳反應程序，對已有的65對引物組合進行PCR擴增，其中，出現條帶的引物組合為57對，占總引物組合的87.69%，擴增條帶共計173條，表明該反應體系具有較高的擴增成功率。其中有23對引物組合擴增出的條帶清晰且多態性豐富，這23對引物組合共計擴增出109條帶，占總條帶數的63.01%。分別挑選出上述的23對引物組合再次進行驗證，SRAP-PCR擴增結果（圖2）顯示，篩選出的23對引物條帶豐富、多態性強、穩定性好，可以用于小麥材料的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、重要性狀標記等，同時用于本項目后續的試驗研究。

圖2　SRAP-PCR擴增程序的驗證結果Fig.2 The verification results of SRAP-PCR program

3　結論與討論

SRAP是適用于多種植物、簡便高效的分子標記檢測手段。SRAP與SSR分子標記由于構建原理不同，從而在諸多方面具有自己獨特的特點，如SRAP-PCR程序采用復性變溫法擴增。這種擴增程序分為2個階段，前5個循環采用較低的退火溫度，以保證2個引物與靶DNA部分配對，隨后循環中升高復性溫度，以保證前5個循環的擴增產物在余下循環中進行指數式擴增，如果復性溫度在所有循環中都保持較低的退火溫度，擴增片斷重復性將很低[11]。不同的引物組合對不同物種擴增多態性影響很大，在利用不同SRAP組合進行多態性篩選時，盡量先統計其多態性，再分析多態性在群體中的分離[12]。如果多種引物組合產生的多態性都不豐富時，有必要對PCR擴增程序進行優化調整。陳萬勝等[13]在煙草中應用的PCR程序為變性45 s，退火45 s，延伸60 s，后35個循環退火溫度52益。而楊麗麗等[14]在冬棗SRAP擴增體系中將延伸時間提高到80 s。傅冰等[15]在藍莓SRAP-PCR反應體系中應用變性時間60 s，退火時間60 s，延伸時間90 s。雖然SRAP的引物可以通用，但不同的試驗對象及不同的試驗環境下，應采用最適合的PCR反應體系。

本研究通過正交試驗設計對小麥SRAP-PCR中的擴增程序進行了優化試驗，結果顯示，最佳的擴增程序是94益預變性5 min；94益變性30 s，35益復性60s，72益延伸60 s，5個循環；94益變性30 s，55益復性60 s，72益延伸60s，35個循環；72益延伸5min，4益保存。篩選出23對條帶豐富、可重復性強的引物組合，適于小麥親本材料及其后代材料的變異、遺傳多樣性以及親緣關系檢測與分析。這23對引物分別為Me1/Em2、Me1/Em4、Me1/Em7、Me1/Em9、Me2/ Em2、Me2/Em5、Me2/Em6、Me2/Em7、Me2/Em8、Me2/Em11、Me2/Em13、Me3/Em1、Me3/Em3、Me3/ Em5、Me3/Em7、Me3/Em9、Me3/Em10、Me3/Em11、Me4/Em4、Me4/Em5、Me4/Em10、Me4/Em13、Me5/Em1。優化后的擴增程序較最初Li等[1]的擴增程序在變性時間上有所減少，可以縮短PCR的時間；在后35個循環的復性溫度上有所提高，可以增加PCR擴增反應的特異性。應用這一優化的擴增程序，成功篩選了適合于小麥的SRAP引物，并充分驗證了該程序的可靠性。

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Program Optimization and Primer Screening of SRAP-PCR for Wheat

ZHANG Yan-bo1，XIAO Lei1，ZHANG Wen-juan2，ZHANG Qing-hua1，DONG Ce1，ZHANG Xi-tai1
（1.Handan Academy of Agricultural Sciences，Handan 056001，China；2.Agriculture Bureau of Handan City，Handan 056002，China）

The purpose of this study was to determine the best system of SRAP-PCR reaction and provide afoundationforfurtherstudyingthegeneticdiversityofwheat.Usingtheorthogonaldesign，the denaturation time，annealing time，extension time and annealing temperature after 35 cycles for wheat SRAP-PCR program were optimized.The results indicated that the best program was the denaturation time of 30 seconds，annealing time of 60 seconds，extension time of 60 seconds，and annealing temperature of 55益after 35 cycles.Under the optimum reaction conditions，23 out of 65 SRAP primer combinations were selected to verify the stability and reliability of this system.This optimized conditions of SRAP could used for further research of molecular marker，auxiliary breeding and genetic diversity in wheat.

Wheat；SRAP-PCR program；Optimization；Primer screening

S512.1垣1

A

1008-1631（2016）02-0055-03

2015-08-11

張彥波（1982-），男，河北武安人，助理研究員，碩士，主要從事農業生物技術及小麥育種研究。E-mail：zhangyanbo785@163.com。