灰樹花多糖的分離純化及體外抗肝癌作用研究

張媛媛，孟夢，王明飛，王春玲（天津科技大學食品工程與生物技術學院教育部食品營養與安全重點實驗室，天津300457）

基礎研究

灰樹花多糖的分離純化及體外抗肝癌作用研究

張媛媛，孟夢，王明飛，王春玲*
（天津科技大學食品工程與生物技術學院教育部食品營養與安全重點實驗室，天津300457）

利用超聲破碎、水提醇沉、葡聚糖凝膠過濾層析等方法，對灰樹花子實體多糖進行分離得到多糖組分GFD-1。高效液相色譜分析表明，GFD-1是分子量為29.574 kDa的多糖均一組分。利用顯色試驗、紫外光譜、紅外光譜及原子力顯微鏡分析，GFD-1為不含還原性羰基、酚羥基、游離或結合蛋白質、核酸類物質的非淀粉類α-吡喃多糖，其糖鏈高度在0.5nm～1nm。GFD-1能夠顯著抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，并呈劑量依賴關系，IC50為94 μg/mL，但其對于正常肝臟細胞L-02無明顯影響；通過AO/EB雙染，經GFD-1作用的HepG2細胞呈典型凋亡形態學特征；經流式細胞儀分析，HepG2細胞被阻遏在S期。上述結果可知，初步確定分離純化的GFD-1是一種具有抗腫瘤活性的均一多糖組分，為開發天然抗腫瘤物質和進一步分析其抗腫瘤作用機制提供了參考。

灰樹花；多糖；分離純化；抗腫瘤

灰樹花［Grifola frondosa（Dicks，ex Fr）S.F.Gray］，又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、蓮花菌等，日本稱之舞茸［1］，美國稱之林雞，隸屬擔子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，其肉質脆嫩，味如雞絲，營養豐富，且含有生物活性物質，能烹調出各種美味菜肴，是近年來開發的一種研究價值的食藥兩用菌。由于其產量大、栽培簡單，目前在全球各地廣泛分布［1］。上世紀80年代以來，國內外學者從灰樹花菌絲體和子實體中提取了包括MT-2、MD-組分、D-組分、Grifolan、X-組分和LELFD在內的數十種活性多糖，結果表明其具有明顯的生理活性［2］，主要包括抗腫瘤、抗HIV病毒、降血糖及增強免疫力功能［3-4］等，已成為生物學、藥學和食品科學等各研究領域的熱點。

腫瘤是嚴重危害人類生命的疾病，其死亡率僅次于心血管疾病，因此對腫瘤的研究一直是醫藥學重點內容之一。肝細胞癌（HCC）是死亡的第三大常見原因癌［5］，手術僅能治療很小一部分患者的病癥，而如此高的死亡率及低治愈率，使得找到有效預防及治療肝癌的控制劑變得十分必要。現階段對灰樹花多糖的抗腫瘤活性研究主要集中于肺癌、卵巢癌［6］、膀胱癌等作用；但針對抗肝癌活性研究的報道還較少。本研究分離純化出一種具有明顯抗肝癌（HepG2）活性的均一灰樹花多糖組分GFD-1，并集中對其結構和抗肝癌活性進行了研究，為進一步深入研究其構效關系和生物活性提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

灰樹花子實體：購自浙江慶元黃田食用菌種植基地；人體正常肝細胞L-02：購自中國醫科大學，天津科技大學食品衛生與安全研究室保存；人體肝癌細胞株HepG2：天津醫科大學饋贈，天津科技大學食品安全與衛生研究室保存。

VECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀：德國布魯克儀器公司；LGJ35冷凍干燥機：軍事醫學科學院實驗儀器廠；高效液相色譜儀：日本島津；TS100倒置相差顯微鏡：日本Nikon；MK-3酶標儀：Thermo。

1.2試劑

葡聚糖凝膠、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、核糖核酸酶溶液：Sigma；杜爾伯科改良伊格爾高糖培養基：Hyclone；胎牛血：Gibco；碘化丙啶（PI）、溴化乙錠（EB）、吖啶橙（AO）：Amresco；其他試劑均為國產分析純。

1.3方法

1.3.1灰樹花子實體多糖的提取

取灰樹花子實體烘干、粉碎，將其粉末溶于80℃熱水（料液比1∶20，g/mL）超聲60 min；90℃熱水浸提10 h，將提取液以7 000 r/min離心10 min；重復離心兩次收集上清，將溶液濃縮至原溶液體積的2/5～3/5后加入3倍體積80%乙醇，4℃過夜，醇沉；將此溶液7 000 r/min離心20 min，收集醇沉物，經無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌后冷凍干燥得子實體多糖粗品。

1.3.2灰樹花子實體多糖的分離純化

取灰樹花粗多糖溶于水，采用Sevage法脫蛋白，將脫色后的多糖溶液裝于超濾杯中，以0.2 MPa左右的壓力通過截留分子量為10 kDa的超濾膜，將超濾杯中的溶液繼續以0.2 MPa左右的壓力通過截留分子量為50 kDa的超濾膜繼續超濾，收集兩組分即粗略制得分子量在10 kDa至50 kDa多糖溶液。多糖溶液離心，取上清經0.45 μm微孔濾膜過濾。上樣于Sephadex-G75色譜柱（26 mm×300 mm），每10 min收集一管，利用苯酚-硫酸法測定各管多糖含量，合并洗脫峰并真空濃縮冷凍干燥，得多糖均一組分（GFD-1）。

1.3.2.1灰樹花多糖GFD-1相對分子質量測定

將GFD-1樣品制成10mg/mL多糖溶液，用0.22μm的微孔濾膜過濾備用，采用高效凝膠滲透色譜法（HPLC）檢測其相對分子質量。選用分離葡聚糖的分子量范圍為10kD～80kDa的ShodexOHpakSB-803HQ凝膠色譜柱，以三蒸水為流動相，調整流速為0.8 mL/min，設定柱溫30℃，待基線平穩后，上樣10 μL，示差檢測器檢測。

1.3.2.2灰樹花多糖GFD-1理化性質的測定

采用斐林試劑反應、雙縮脲反應、硫酸咔唑反應、碘反應、三氯化鐵反應、苯酚硫酸法對灰樹花多糖GFD-1組分進行理化性質的測定分析。

1.3.2.3紫外掃描（UV）

將多糖樣品配制成1mg/mL的溶液，在波長190 nm～400 nm范圍內進行掃描。

1.3.2.4紅外光譜定性分析（IR）［7-8］

將瑪瑙研缽用蒸餾水洗凈、自然干燥，加入100 mg干燥的KBr研磨成細粉，實驗組加入1 mg GFD-1多糖樣品混合均勻研磨至2 μm以下的顆粒。在擦拭干凈的壓片模具里放入研磨好的粉末，將其堆積成中間高、四周低的小山形，加壓約15 s制成透明薄片。以純KBr薄片為空白，測空白背景，再將試樣薄片置于光路中，測定樣品紅外光譜。

1.3.2.5原子力顯微鏡（AFM）觀察GFD-1結構［9］

將云母片表層撕去，用乙醇及超純水進行清洗、晾干。將多糖樣品用超純水配制成100 μg/mL的溶液點在云母片上，置于干燥器中晾干后，在原子力顯微鏡下觀察并在輕敲模式下記錄結果。

1.3.3灰樹花多糖GFD-1抗腫瘤活性研究

1.3.3.1細胞體外增殖抑制實驗（MTT）［10］

待培養結束后，將96孔板從培養箱中取出，向各孔中加入0.5 mg/mL MTT溶液20 μL，繼續置于培養箱中培養4 h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分振蕩酶標板使甲臜溶解；用酶標儀檢測各孔吸光度A值，檢測波長為570 nm，參比波長為630 nm。

式中：A對照組為未經GFD作用的細胞吸光度值；A試驗組為利用GFD-1作用細胞組的吸光度值。

1.3.3.2灰樹花多糖GFD-1抗腫瘤形態學觀察（AO/ EB）雙染

細胞培養結束后，用70%的冰乙醇固定15 min，加入等體積混合的AO、EB染色液于37℃避光孵育20 min，用PBS洗去殘留染液，瀝干液體，蓋在載玻片上用LSCM觀察細胞形態變化并采集細胞圖像。

1.3.3.3流式細胞術分析細胞凋亡率及細胞周期［11］

待培養結束后，用70%冰乙醇4℃固定18 h，用核糖核酸酶溶液（1.0 g/L）在37℃水浴中處理30 min后，加入75 μmol/L碘化丙啶（PI）250 μL，4℃避光染色30 min，流式細胞儀對著色細胞進行分選檢測并檢測細胞凋亡率，激發波長為488 nm，發射波長為630 nm。

2　結果與分析

2.1GFD-1相對分子質量及純度鑒定

通過Sephadex G-75葡聚糖凝膠色譜圖（圖1）結果分析，以苯酚-硫酸法作洗脫曲線，洗脫曲線峰型為單一對稱峰，說明GFD-1為均一多糖。

圖1　GFD-1葡聚糖凝膠洗脫曲線Fig.1　Sephadex G-75 chromatographic separation of GFD-1

利用高效液相色譜測定GFD-1的分子量范圍，結果如圖2所示。

圖2　GFD-1高效液相色譜圖Fig.2　Analysis and detection of GFD-1 by HPLC

多糖圖譜有單一對稱主峰，峰面積比為91.57%，進一步證明GFD-1為性質均一的多糖類物質，分子量校正曲線所用標準品為Dextran系列，測得多糖分子量為29.574 kDa。

2.2GFD-1理化性質分析

灰樹花多糖GFD-1冷凍干燥后為白色絮狀固體，易溶于沸水，可溶于稀酸、稀堿、稀鹽溶液，不溶于乙醇、甲醇、氯仿、丙酮、正丁醇等有機溶劑。斐林試劑反應陰性，說明分子中不含有游離態羰基結果；雙縮脲反應陰性，證明了不含蛋白質類物質；硫酸-咔唑反應陽性，說明含有糖醛酸；碘-碘化鉀反應陰性，說明不含淀粉類物質；三氯化鐵反應陰性，說明不含酚類或鞣質；苯酚-硫酸反應陽性，證明為糖類物質。上述顯色實驗證實，GFD-1為不含有還原性羰基和酚羥基的非淀粉類多糖。

2.3紫外光譜檢測

對灰樹花多糖GFD-1進行190 nm～800 nm紫外光譜全波長掃描，結果如圖3所示。

圖3　GFD-1紫外掃描圖譜Fig.3　UV scanning of GFD-1

GFD-1在199 nm有最大吸收峰，在260 nm和280 nm均無明顯的光吸收，說明GFD-1不含游離結合的蛋白質、核酸類物質，此結果與雙縮脲實驗結果相吻合。

2.4紅外光譜檢測

采用傅立葉紅外光譜（FT-IR）分析GFD-1的官能團、結構特征、糖殘基及其構型情況，結果如圖4。

圖4　GFD-1紅外分析圖譜Fig.4　IR spectroscopic analysis of GFD-1

圖譜中3 384 cm-1處的寬峰O-H的伸縮振動、2 922 cm-1～2 852 cm-1是C-H的伸縮振動，這一區域的吸收峰是糖類的特征吸收峰；1 700 cm-1～1 775 cm-1處無吸收，表明樣品中沒有羧基結構，即多糖不含有葡萄糖醛酸，是一種中性糖；1 631 cm-1～1 600 cm-1（C=O）及1 401 cm-1（C-H）處均為多糖的特征吸收峰。1 200 cm-1～1 000 cm-1間比較大的4個峰是C-O伸縮振動，由于呋喃型糖環在此區間上只有兩個強吸收峰，說明GFD-1糖環構型為吡喃型；933 cm-1的吸收峰是D型吡喃葡萄糖的非對稱環伸縮振動的特征吸收峰；β型糖苷鍵的吸收峰在890 cm-1左右處，據此推斷760 cm-1的吸收峰糖苷鍵可能為α型，以上說明灰樹花多糖GFD-1可能為α-吡喃多糖。

2.5原子力顯微鏡觀察GFD-1

原子力顯微鏡（AFM）結果如圖5所示。

圖5　GFD-1的原子力顯微鏡分析Fig.5　AFM analysis of GFD-1

可以在視野下看到縱橫交錯的多糖GFD-1分子的多分支鏈狀結構，形成立體多層網狀，證明GFD-1具有多糖分子典型的多分支結構；并且根據AFM圖可以看出GFD-1是由長度在0.5 nm～1.0 nm左右的糖鏈組成。

綜合上述結果分析可知，實驗室分離純化得到的GFD-1灰樹花多糖單一組分為分子量29 574、不含還原性羰基、酚羥基、游離或結合蛋白質、核酸類物質、糖鏈高度在0.5 nm～1 nm左右的非淀粉類α-吡喃多糖。

2.6細胞體外增殖抑制實驗（MTT）

利用濃度10 μg/mL～100 μg/mL的GFD-1作用于細胞48 h后，其MTT實驗結果如圖6。

圖6　GFD-1對HepG2和L-02的體外抑制作用（MTT）Fig.6　Cell inhibition and proliferation tests of GFD-1 on HepG2 cells and L-02 cells（MTT）

GFD-1可明顯抑制HepG2細胞的增殖，且抑制率隨濃度的增加而增加，呈劑量依賴關系。而在此濃度范圍內，GFD-1對人體正常肝細胞L-02生長抑制較小。以上實驗結果表明，GFD-1能特異性地殺滅腫瘤細胞，而對人體正常細胞的毒副作用較小。通過式（1）計算經不同濃度的GFD-1處理細胞48 h后對HepG2細胞的抑制率，利用SPSS軟件分析得出其對HepG2細胞的半抑制濃度（IC50）為94 μg/mL。

2.7AO/EB雙染檢測細胞凋亡

AO染料能透過完整的細胞膜與DNA結合，使細胞呈綠色熒光；EB染料只能透過受損的細胞膜與DNA結合，使細胞核呈橘紅色熒光。采用94 μg/mL的GFD-1作用于HepG2細胞AO/EB雙染結果如圖7所示。

圖7　AO/EB雙染觀察GFD-1誘導HepG2細胞凋亡（40×10）Fig.7　Observation of GFD-1-induced apoptosis in HepG2 cells by AO/EB staining（40×10）

正常細胞（圖7A）胞膜完整，細胞被染成均勻的綠色熒光，無凋亡形態改變；經GFD-1作用48 h后，細胞呈晚期凋亡形態：核染色質固縮，被致密濃染成亮綠色或黃綠色熒光，部分細胞胞膜皺縮起泡，即出現凋亡小體（如箭頭所示），圖中可見部分壞死細胞呈橘紅色濃染，細胞核、細胞質界限模糊（如箭頭所示）。AO/EB雙染結果說明，GFD-1可引起HepG2細胞發生核固縮或核碎裂等特征誘導的細胞凋亡。

2.8流式細胞術分析細胞凋亡率和細胞周期

利用流式細胞儀對GFD-1作用的HepG2細胞進行凋亡率及細胞周期的檢測，結果如圖8和表1所示。

圖8　GFD-1對HepG2凋亡率的影響Fig.8　Effect of GFD-1 on apoptosis and cell cycle of HepG2 cells

表1　GFD-1對HepG-2細胞凋亡率及細胞周期影響Table 1　Effect of GFD-1 on apoptosis and cell cycle of HepG2 cells

由檢測結果可知，HepG2細胞經94 μg/mL GFD-1處理48 h后，細胞凋亡率從1.89%增加至39.27%，說明GFD-1可以誘導HepG2細胞發生凋亡。通過結果也可以發現，其細胞周期也發生了明顯變化，與G0/G1期和G2/M期細胞數比例下降不同，S期細胞數比例從15.82%高至52.18%，由此判定HepG2細胞被阻斷在S期。S期在細胞周期中是進行DNA合成的階段，說明GFD-1致使HepG2細胞不能正常合成DNA，從而抑制HepG2細胞的正常生長增殖。

3　結論

通過水提醇沉、凍干、脫蛋白及超濾分離后經過Sephadex G-75葡聚糖凝膠柱色譜得到灰樹花多糖單一組份GFD-1。通過高效液相色譜證明GFD-1為性質均一的多糖類物質，并且測定了多糖分子量。利用顯色實驗、紫外光譜、紅外光譜及原子力顯微鏡初步分析該均一多糖組分GFD-1為不含還原性羰基、酚羥基、游離或結合的蛋白質、核酸類物質的非淀粉類α-吡喃多糖，糖鏈高度在0.5 nm～1 nm左右。

細胞體外增殖抑制實驗（MTT）表明GFD-1在一定濃度范圍內能夠顯著抑制肝癌細胞株HepG2的生長，并呈時間依賴，IC50為94 μg/mL；用相同濃度GFD-1分別作用HepG2細胞和人體正常肝細胞L-02時，GFD-1對人體正常肝細胞影響較小，即GFD-1可以選擇性地抑制肝癌細胞和人體正常細胞。流式細胞術（FCM）檢測經GFD-1處理的HepG2細胞發生了S期阻滯，并誘導細胞發生凋亡。通過染色對細胞進行形態學觀察發現：GFD-1作用HepG2細胞后，細胞呈現出明顯的凋亡形態學改變，即GFD-1能誘導HepG2細胞發生凋亡。

灰樹花多糖構效關系有待進一步深入研究，擬在本實驗研究基礎上，對灰樹花多糖的單糖組成及其連接方式等進行后續研究，闡明灰樹花多糖的構效關系，從而為灰樹花多糖的深度開發利用提供科學參考。

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Isolation，Purification and in Vitro Antitumor Activity of Polysaccharides GFD-1 from Grifola frondosa

ZHANG Yuan-yuan，MENG Meng，WANG Ming-fei，WANG Chun-ling
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

A polysaccharide GFD-1 from Grifola frondosa fruiting bodies had been purified by sonication，water extraction，alcohol precipitation and Sephadex gel filtration chromatograp.By HPLC，GFD-1 was a kind of polysaccharide homogeneous components and its molecular weight was 29.574 kDa.The results of the color experiment，ultraviolet spectroscopy，infrared spectroscopy and atomic force microscope analysis illustrated that GFD-1 was a kind of non-starch α-pyran polysaccharide without reductive carbonyl，phenolic hydroxyl，free or a combination protein and nucleic acid；its sugar chain height was 0.5 nm-1 nm.GFD-1 inhibited proliferation of HepG2 cells in a dose-dependent manner，the IC50of GFD-1 was 94 μg/mL；it had no significant effect on the cell viability of humor normal liver L-02 cells.Meanwhile，in the presence of with GFD-1，HepG2 cells showed typical apoptotic morphological features through the AO/EB double staining.Flow cytometry analysis suggested that HepG2 cells were repressed at the phase S by GFD-1.These results showed that GFD-1 purified from Grifola frondosa possesses anti-tumor regulation effect，serving a reference basis to develop natural anticancer drugs and further analyse the anti-tumor mechanism of GFD-1.

Grifola frondosa；polysaccharide；isolationandpurification；antitumoractivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.001

“十二五”國家科技支撐計劃（2012BADB33B04）；國家自然科學基金（31000768）

張媛媛（1987—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品生物技術。

2015-08-27