幾種耐高溫淀粉酶的酶活影響因素研究

鄭美娟，郭金玲，余華順，姚鵑，龔大春，*（.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌44300；.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點實驗室，湖北宜昌44300）

幾種耐高溫淀粉酶的酶活影響因素研究

鄭美娟1，郭金玲1，余華順2，姚鵑2，龔大春1，*
（1.三峽大學生物與制藥學院，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點實驗室，湖北宜昌443002）

淀粉酶是食品、發酵行業應用最廣泛的酶種之一。從最適溫度、最適pH值、保存溫度、緩沖溶液pH值等方面對5種不同的耐高溫α-淀粉酶酶活的影響進行了研究。結果表明：耐高溫α-淀粉酶B的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之間，相對酶活為98%～100%；耐高溫淀粉酶A的耐高溫性最好，在反應溫度70℃～100℃之間，相對酶活為100%～121%；耐高溫α-淀粉酶A的緩沖溶液穩定性最好，在緩沖溶液pH4.50～7.00之間，酶活維持在91%～100%；耐高溫α-淀粉酶E溫度穩定性質最好，在儲存溫度30℃～60℃之間，相對酶活為98%～100%。為淀粉酶的選擇奠定基礎。

耐高溫α-淀粉酶；酶活；影響因素

α-淀粉酶是目前國際市場上非常熱門的酶制劑之一，被廣泛應用于淀粉加工、酒精制造、味精、醬油、造紙等行業。近年來，隨著現代工業技術的發展，以淀粉為原料的成品愈來愈多，淀粉原料在深加工中所處的反應環境也變得苛刻，如高溫、強酸、強堿等［1-3］。原有的淀粉酶會造成原料的利用率低，化學工藝復雜，下游處理繁瑣等。因此開發新型的耐酸性高溫α-淀粉酶具有重要的前景意義［4-9］。目前市場的行業領導者是美國的杰能科和丹麥諾維信α-淀粉酶產品，酶活高且對工業生產的各種酸環境和高溫都能有很強的耐受性。我國市場上的α-淀粉酶的種類繁多，但是品質參差不齊，在液化和糖化的效果上與國際主流的幾個淀粉酶制劑公司差距較大，因此對市場上的耐酸性高溫α-淀粉酶的酶學性質進行研究，能夠清楚了解整個α-淀粉酶行業的現狀，對企業菌種的研發，淀粉酶的生產，合理的銷售目標，準確的市場定位均具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1試劑及儀器

A、B、C、D、E、F公司的耐酸性高溫α-淀粉酶、淀粉、醋酸（分析純AR）、十二水磷酸氫二鈉（分析純AR）、檸檬酸（分析純AR）、碘化鉀（分析純AR）、0.1 mol/L鹽酸、0.1 mol/L氫氧化鈉（分析純AR）、無水乙醇（分析純AR）、考馬斯亮藍（分析純AR）、牛血清蛋白：天津市科密歐化學試劑有限公司。

20RP-52D自動高速冷凍離心機：日本日立公司；NH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；pHS-25酸度計：上海雷磁儀器廠；ZD-2型自動電位滴定儀：上海雷磁儀器廠；TG16A-WS離心機：上海盧湘儀器廠；721W型分光光度計：上海儀器分析廠。

1.2方法

1.2.1蛋白質標準曲線的測定

準確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的牛血清蛋白標準溶液于試管中，然后用無離子水補充到1 mL，最后每支試管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑，每次添加之后立即用漩渦混合器振蕩混合，反應5 min后在595 nm波長的分光光度計測量其吸光值，空白對照為含0.0 mL的牛血清蛋白試管。

1.2.2酶液蛋白質含量測定

準確稀釋酶液，使吸光值在合理的區間（0.100～0.768），吸取1.00 mL的稀釋酶液，加入5.00 mL的考馬斯亮藍染料試劑，空白樣加1.00 mL雙蒸水和5.00 mL的考馬斯亮藍染料試劑，在5 min～10 min內在595 nm波長下測量吸光值，根據標準曲線計算出蛋白質含量。

1.2.3耐酸性高溫α淀粉酶酶活測定

耐酸性高溫α淀粉酶酶活采用分光光度法測定。

1.2.4α-淀粉酶理化性質研究方法

1.2.4.1pH值穩定性

設計酶液 pH值梯度為 4.00、4.50、5.00、5.50、6.50、7.00、7.50。取耐酸性高溫淀粉酶約40 mL，分別用20%的乙酸和0.01 mol/L的氫氧化鈉調制酶液至所需pH值，置于30℃保存18 h后稀釋國標檢測酶活。計算酶活力收率。

1.2.4.2最適反應溫度

最適反應溫度設計梯度為60、70、80、90、95、100℃，將酶液在pH為6.0的緩沖溶液中，在梯度溫度下進行測量，計算酶活力收率。

1.2.4.3最適作用pH值

用十二水合磷酸氫二鈉、檸檬酸配置緩沖溶液，pH值梯度為4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，采用國標檢測酶活。

1.2.4.4溫度穩定性

取適量的樣品在試驗梯度為40、45、50、60℃溫度下保存3 d，采用國標檢測酶活，計算酶活收率。、

1.2.5酶活測定步驟

1）吸取可溶性淀粉溶液20.0 mL于試管中，加入磷酸緩沖液5.00 mL，搖勻后，于70℃恒溫水浴鍋中預熱5 min

2）加入稀釋好的待測酶液1.00 mL，立即計時搖勻，準確反應5 min

3）反應時間終止，立即吸取反應液1.00 mL，加入到預先盛有0.5 mL鹽酸溶液和5.00 mL稀碘液的試管中，搖勻，并以0.5 mL的鹽酸和5.00 mL稀碘液的作為空白樣，于660 nm波長下，用比色皿迅速測定器吸光度A，根據吸光度表求得測試酶的濃度C。

酶活：耐高溫α-淀粉酶X=C×n/16.67

式中：C為測試酶液的濃度，μ/g；n為樣品的稀釋倍數；16.67為根據酶活定義計算的換算系數。

1.3蛋白質相對分子質量測定

采用SDS-PAGE電泳測定蛋白質相對分子質量。

2　結果與結論

2.1不同pH值對淀粉酶活性影響

不同的pH值對淀粉酶活的影響見圖1。

將這6種耐酸性高溫α-淀粉酶在pH值梯度4.00～7.50的酶活變化總結在一個表中可以清楚的了解各種酶之間對耐酸性的程度大小。其中B、C、D這3種酶的耐酸性都強，普遍的適合淀粉生產的強酸環境，A、E、F這3種酶在pH5.00以下的環境中酶活影響較大，不太適合更強酸環境的生產中使用。

3.2最適反應溫度

不同溫度對淀粉酶酶活的影響見圖2。

由圖2可知，這幾種高溫淀粉酶，在70℃之前，溫度對酶活的影響基本相同，但是在70℃以后，溫度對酶的影響漸漸呈現出來，A、F這兩種酶在高溫的環境中更能發揮催化作用，酶活能超過國標中測定的酶活，在淀粉酶的液化當中，可以更加的發揮作用；B、C、D、E這幾種酶在高溫的時候，酶活下降的趨勢都比較明顯，有些的變化趨勢和中溫淀粉酶的趨勢一樣，在實際的生產中，要達到同樣的液化效果，所需要的酶劑量要更大。

圖1　不同的pH對淀粉酶活的影響Fig.1　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase

圖2　不同溫度對淀粉酶酶活的影響Fig.2　The effect of different temperature on the enzymatic activity of amylase

3.3緩沖溶液對酶活的影響

緩沖溶液的不同pH對各種酶活的影響見圖3。

圖3　 緩沖溶液的不同pH值對各種酶活的影響Fig.3　The effect of different pH on the enzymatic activity of amylase in buffer solution

緩沖溶液時保證反應的的時候，整個反應液體系中pH穩定性，如圖3所示，F酶活在緩沖溶液的低pH值的時候有較大的影響，B、C、D、E這4種酶活在6.5～7.00區間內，酶活有較大幅度的下降，其中的具體原因有待研究。

3.4保存溫度對酶活的影響

保存溫度對各種酶活的影響見圖4。

圖4　 保存溫度對各種酶活的影響Fig.4　The effect of the storage temperature on the enzymatic activity of amylase

由圖4分析可知，溫度對各種酶活的影響均不同，在45℃以下酶活均為出現較大的變化。但是在此之后，各種酶由于本身的特性，酶活開始出現下降，特別是A、B酶，保存溫度對其酶活的影響較大。因此，為了防止α-耐酸性高溫淀粉酶的熱變性，應該放置低溫保存。

3.5耐酸性高溫淀粉酶中蛋白質的含量

3.5.1蛋白質標準曲線

蛋白質標準曲線見圖5。

圖5　 蛋白質標準曲線Fig.5　The standard curve of the protein

由圖5可見，蛋白濃度標準曲線呈一條直線，曲線方程為：y=0.505 4x+0.025 6，R2=0.995 6，在蛋白濃度為0～1.0g/L范圍內時，隨著蛋白質濃度的增加，顯色后的光吸收值OD595，線性增加，因此當測定溶液中蛋白濃度時，只要顯色后的光吸收值OD595在圖中的直線范圍內就可以參照標準曲線比較準確的計算出被測溶液的淀粉濃度。

3.5.2A、B、C、D、E、F酶中蛋白質的測定酶液蛋白質含量見表1。

表1　酶液蛋白質含量Table 1　The contain of the protein in the enzymatic liquid

結合各公司的酶活，可以知道酶活的高低和酶含量沒有太多的關聯，可推測在提取酶液的工藝中不需要追求單位內的酶活大小而特意濃縮酶液，酶的活力的大小與酶的結構和催化位點決定酶活大小。

4　結論

對A、B、C、D、E、F公司耐酸性高溫α-淀粉酶的酶學性質研究發現，這6種酶的理化性質有共同的特征，也有不相同的特征。各種酶對耐酸性、耐高溫性、保存的溫度環境，反應體系液體的緩沖pH表現出來的酶活穩定差異性較大，這決定了在實際的工業生產所使用的領域不同。B公司的耐酸性高溫α-淀粉酶的耐酸性最好，在pH4.00～7.50之間，相對酶活為98%～100%；A公司的耐酸性高溫淀粉酶的耐高溫性最好，在反應溫度70℃～100℃之間，相對酶活為100%～121%；A公司的耐酸性高溫α-淀粉酶的緩沖溶液穩定性最好，在緩沖溶液pH4.50～7.00之間，酶活維持在91%～100%；E公司的耐酸性高溫α-淀粉酶溫度穩定性質最好，在儲存溫度30℃～60℃之間，相對酶活為98%～100%；E公司的蛋白純化最好，單位蛋白酶活相對最高。

［1］石方方，焦國寶.耐酸耐高溫α-淀粉酶的研究進展［J］.中國食品添加劑，2014（4）：171-176

［2］董晨，曹娟，張跡，等.耐高溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的高效表達［J］.應用與環境生物學報，2008，14（4）：534-538

［3］季慧，紀艷青，孔宇.復合淀粉酶水解米粉的工藝優化［J］.糧食與飼料工業，2015（1）：28-34

［4］崔錦，柯濤，馬向東.α-淀粉酶基因在畢赤酵母中的表達及酶學性質研究［J］.河南農業大學學報，2006，40（3）：311-314

［5］Janecek S.Sequences similarities and evolutionary relationships of microbial plant and animal α-amylases［J］.Eur J Biochem，1994，224 （5）：519-524

［6］Ohdan K，Kuriki T，Kaneko H，et al.Characteristics of two forms of α-amylases and structural implication［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（8）：4652-4658

［7］YaoWei Rong，Yao Hui Yuan.Adsorbent Characteristics of Porous Starch［J］.Starch，2002，6（54）：260-263

［8］ MeddaS，Chandra AK.New strains of Bacillus licheniformis and Bacillus coagulans producing thermostable a-amylase active at alkaline pH［J］.Journal of Applied Bacteriology，1980，48（1）：47-58

［9］羅志剛，楊景峰.a-淀粉酶的性質及應用［J］.食品研究與開發，2007，28（8）：16-18

Study on the Enzymatic Activity Effects of Several Thermostable α-Amylases

ZHENG Mei-juan1，GUO Jin-ling1，YU Hua-shun2，YAO Juan2，GONG Da-chun1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical，Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China；2.Yeast Function of Hubei Key Lab.，Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443002，Hubei，China）

α-Amylase is one of the most extensive enzyme for food and fermentation industry.Several thermostable α-Amylase enzymatic activity effect was studied from the optimal temperature，the optimal pH，the storage temperature and buffer solution pH.The results showed that B company's thermostable α-Amylase acid resistance was preferably with the relative activity of 98%to 100%between 4.00-7.50 pH and A company's thermostable amylase temperature resistance was the best with the relative activity 100%to 121%between 70℃-100℃and the thermostable α-Amylase of Company A buffering ability was the best in a buffer solution pH value between 4.50-7.00 with the activity from 91%to 100%and the E company's α-Amylase have the best temperature stability from 30℃to 60℃storage temperature with the relative activity of 98%to 100%. This research will provide the basis for the select of α-Amylase.

thermostableα-Amylase；enzymaticactivity；effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.013

鄭美娟（1977—），女（漢），講師，碩士研究生，從事生物學的教學與研究。

龔大春（1967—），教授，博士，從事生物催化與生物能源的研究與開發。

2015-08-25