擬青霉發酵生產胞外多糖的研究

張嬙，葉明（1.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川750021；2.合肥工業大學生物與食品學院，安徽合肥230009）

擬青霉發酵生產胞外多糖的研究

張嬙1，2，葉明2，*
（1.北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏銀川750021；2.合肥工業大學生物與食品學院，安徽合肥230009）

探討擬青霉屬產胞外多糖和菌絲體生物量最大時的液體培養條件的優化，主要考察培養基組分、碳氮比和物理參數這三方面的影響。結果表明，最適培養基配方為葡萄糖30 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。最適培養條件為27℃，搖床轉速400r/min，培養時間為7d。在此條件下，擬青霉屬胞外多糖的產量為2.51g/L，菌絲體生物量為23.5g/L。

擬青霉屬；胞外多糖；菌絲體生物量

近年來，許多從蘑菇分離得到的天然多糖和多糖蛋白復合物已被用于藥物治療。研究證明，擔子菌類蘑菇多糖具有很強的藥效，如預防腫瘤、直接抵抗腫瘤、與化學藥物協同抗擊腫瘤及對腫瘤轉移有抑制作用［1-2］。

擬青霉菌，是一類子囊菌昆蟲病原真菌，據報道有很多的生物活性，如抗腫瘤，抗免疫過敏和抗氧化活性［3-4］。天然子實體的產量是有限的，采用人工培育子實體已被證明難以實現。然而，采用最佳的液體培養條件，在發酵罐內的菌絲體和生物活性分子可以顯著增加，同時縮短了發酵時間及受污染程度。大量研究表明，可以通過微生物液體培養，使其代謝產生胞內或胞外生物活性成分，這可應用于保健食品［5］。目前基于菌體次生代謝產物的液體培養條件優化已有大量研究，但關于擬青霉菌的液體培養近幾年才有所報道。

菌體生長所需的營養物質，如碳和氮，在細胞增殖和代謝生物合成中有重要作用，培養基質中組分對于任何發酵物質的產量都很重要。因此，如果可以克服擬青霉菌在液體培養基內的拮抗性，培養的菌絲體和其代謝產生的活性物質就可應用于食品加工［6］。因此，本文的目的就是基于菌絲體生物量和胞外多糖的量，優化擬青霉菌液體培養基和培養條件，以期為開發出安全、高效的擬青霉菌多糖保健品提供理論依據和技術指導。

1　材料與方法

1.1材料

擬青霉菌菌株：分離并保存于北方民族大學生物科學與工程學院微生物資源實驗室。

1.2微生物和液體培養

菌絲生長的培養基為YMP：10.0g/L葡萄糖、10.0g/L酵母膏、15.0 g/L麥芽提取物、10.0 g/L蛋白胨。

5L發酵罐內菌絲體生長的培養基：30.0g/L葡萄糖、20 g/L酵母膏、0.5g/L KH2PO4、0.1 g/L CuCl2·2H2O。

種子液制備：250 mL搖瓶中裝入含有8 mL活性原液的50 mL YMP培養基，培養3d。對于菌絲體的增長，菌絲體用高速攪拌機混合均勻，2%的種子培養基注入50 mLYMK基質，置于搖床培養8 d（27℃，200 r/min）后，然后在5L發酵罐內發酵。接種量為2%（體積比）。為了考察各參數對胞外多糖的影響，通風比從0.5 vvm增加至1.5vvm，攪拌速度從100r/min變化至500r/min。

1.3菌絲體生物量和胞外多糖的測定

培養結束后，不同發酵條件下的發酵液于5 000 r/min離心20min。菌絲體水洗3次，50℃低溫烘干。發酵液透析后，用3倍體積乙醇沉淀，4℃靜置過夜，0.45 mm濾紙過濾，沉淀于60℃干燥至恒重。胞外多糖的計算采用苯酚-硫酸法［7］。

1.4統計分析

在本試驗中所有數據均平行3次，結果為平均值±標準偏差。

2　結果與討論

2.1溫度和初始pH的影響

為了研究溫度對菌絲體生長和胞外多糖（EPS）產生的影響，在擬青霉菌培養過程中改變不同的溫度（15℃～33℃），其它條件不變，發酵后測定多糖及生物量，結果見圖1。

圖1　溫度對擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產量的影響Fig.1　The effect of temperature on mycelium growth and EPS production

如圖1所示，基于擬親霉胞外多糖產率選取最佳的培養溫度，EPS產生的最適培養溫度為27℃。此時，菌絲體生物量雖然不是最大，但對于擬青霉發酵產生的胞外多糖，在27℃時更有利于代謝產生。故選取27℃作為發酵溫度。

在培養環境中，培養pH對細胞形態學和代謝物合成有顯著影響。本試驗中，改變初始pH4.0～11.0，結果如圖2所示。

圖2　初始pH對菌絲體和胞外多糖產量的影響Fig.2　The effect of pH on mycelium growth and EPS production

如圖2所示，在弱酸或中性環境（pH 5.0～8.0）下，能夠產生較多的菌絲體和EPS，其在中性pH條件下，更適宜液體培養基中細胞的生長和EPS的產生，而且菌絲體會產生有機酸，這會降低中性pH至適宜培養條件。

2.2碳源和氮源的影響

擔子菌的液體培養過程中，不同的碳源會影響菌絲體的生長及其代謝產物。為了找到擬青霉菌的菌絲體生長和EPS產生的適宜碳源，1.0%（g/mL）的不同碳源在無糖培養基中培養4 d。結果如圖3所示。

圖3　碳源對擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產量的影響Fig.3　The effect of different carbon source on mycelium growth and EPS production

研究發現，與無糖培養基相比，含有碳源的培養基利于菌絲體生長。在含有各種碳源的培養基中，葡萄糖做碳源的培養基產生EPS最多，其次是淀粉（圖3）。因此，葡萄糖被作為主要的碳源，這是由于其價格低廉、易于工業化。

氮源對菌絲體生長和多糖產生也有重要影響。為了研究氮源對擬青霉菌的菌絲體生長和EPS產生的影響，0.5%的無機氮源和有機氮源分別加至無氮培養基。在本試驗中，選取8種氮源，結果如圖4所示。

圖4　氮源對擬青霉菌菌絲體和胞外多糖產量的影響Fig.4　The effect of different nitrogen source on mycelium growth and EPS production

如圖4所示，添加酵母膏的培養基產生的菌絲體最多（7.10 g/mL），EPS含量最高（0.46 g/mL），同時含有機氮源的培養基中的菌絲體產量明顯高于無機氮源的，主要是有機氮源不僅含有蛋白質和氨基酸，而且含有其它生長因子等，有利于菌絲體的生長及代謝產物的產生。

2.3碳氮比的影響

為了研究碳氮比對擬青霉菌絲體生長和EPS生產的影響，改變葡萄糖濃度：10 g/L～60 g/L，固定酵母膏濃度，即改變不同的碳氮比（1∶1～6∶1），結果見表1。

如表1所示，碳氮比為1∶1～5∶1時適宜菌絲體生長和EPS產生，當碳氮比為2∶1時，菌絲體和EPS產量最高。葡萄糖濃度較高時，供菌絲體生長和EPS產生的底物減少。

表1　碳氮比對菌絲體生物量和多糖的影響Table 1　Effects of C/N Ratio on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

2.4微量元素的影響

為了研究礦物質和微量元素對菌絲體生長和EPS產生的影響，在培養基中添加1.0g/mL礦物質和0.1g/mL的微量元素。對照組為僅含有10 g/mL葡萄糖、5 g/L酵母膏、不含有礦物質和微量元素。添加0.5 g/mL KH2PO4，以適宜擬青霉菌絲體的生長和EPS的產生。報道稱PO43-參與多糖的生物合成，低濃度的礦物元素對生長效應和EPS產生有重要影響。鐵離子是亞鐵紅素輔酶，參與電子轉移反應。錳離子是超氧化物歧化酶的輔酶，而且對酶催化反應很重要，尤其是針對應用于ATP和合成DNA、RNA的酶。在真菌的液體培養基中，添加不同礦物質可以促進菌絲體的生長和EPS產生。本試驗添加了0.1 g/mL CuCl2·2H2O，促進了擬青霉菌EPS的產生。其結果如表2所示。

表2　微量元素對菌絲體生物量和多糖的影響Table 2　Effects of trace element on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表2所示，最佳組合為K2HPO4和MgSO4，這一結果與Ca2+的積累通過酶的作用抑制真菌的生物代謝物的合成理論一致。

2.5攪拌作用對菌絲體生長和EPS產生的影響

攪拌強弱對底物、加熱和溶解氧（DO）轉移都有重要影響。攪動會產生剪切力，這會引起菌絲體形態學變化，溶解氧和剪切力對多糖產生有重要影響。本試驗通過改變搖床攪拌速度，其它條件不變，測定發酵液中的多糖產率及菌絲體生物量，結果見表3。

表3　攪拌作用對菌絲體生物量和多糖的影響Table 3　Effects of agitation on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

由表3可見，當攪拌速度最大時，葡萄糖消耗水平較高。當攪拌速度為100 r/min時，由于相對傳質較慢，殘余葡萄糖消耗緩慢。當攪拌速度為400 r/min時，菌絲體含量最多（23.1 g/mL），EPS產量最高（2.51 g/mL）。關于擬青霉菌的攪拌促成的細胞形態學和EPS，在低攪拌速度時可形成一簇菌絲體。當攪拌速度較大，通風好，底物濃度合適時，與自由菌絲體相比，菌絲體主要呈球狀。而且，擬青霉菌的球形菌絲體會影響EPS的產生。

2.6通風對菌絲體生長和EPS產生的影響

通風輔助次級代謝產物中底物、產物和氧的傳質。因此，通風強度是影響EPS產生的一項重要因素。在本研究中，其它發酵條件不變，只改變發酵時的通風狀況，測定發酵后的多糖產率及菌絲體生物量，結果如表4。

表4　通風對菌絲體生物量和多糖的影響Table 4　Effects of aeration on mycelia biomass and EPS production by Paecilomyces japonica

如表4可知，當通風1.0 vvm時，菌絲體數量達到最大（23.5 g/mL），EPS也達到最高（2.51 g/mL）。對于液體培養基中多種擔子菌產生EPS，前人也報道過類似結果［8-9］。

3　結論

綜上所述，為了得到最多的擬青霉菌EPS和菌絲體，本文研究了液體培養基的最優培養條件和基質組分。通過試驗確定，最優培養基為30 g/mL葡萄糖，20 g/mL酵母膏，0.5 g/mL KH2PO4和0.1 g/mL MgSO4· 7H2O。最適培養條件為溫度27℃、轉速400 r/min和通風1.0 vvm，初始pH不受限制。采用最優培養條件和調整后的培養介質，5 L生物反應器內發酵培養，菌絲體生長最大可達23.5 g/mL，EPS最高可到2.51 g/mL。

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Research on Fermentation of Exo-polysaccharides from Paecilomyces japonica

ZHANG Qiang1，2，YE Ming2，*
（1.Life Sciences&Engineering College，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

The liquid culture conditions were optimized for maximal production of mycelial biomass and exopolysaccharide by Paecilomyces japonica.The effects of medium composition，C/N ratio and physical parameters were investigated.From these experiments，30 g/L glucose，20 g/L yeast extract，0.5 g/L KH2PO4，and 0.1 g/L MgSO4in distilled water were found to be the most suitable carbon，nitrogen，and mineral sources，respectively. The optimal temperature，initial pH，agitation，and aeration were determined to be 27℃，uncontrolled pH，400 r/min and for 7d，respectively.Under these optimal conditions，the maximum mycelial growth and polysaccharides production were 2.51 g/L and 23.5 g/L，respectively.

Paecilomycesjaponica；exo-polysaccharide；mycelialgrowth

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.033

張嬙（1980—），女（漢），講師，博士，研究方向：天然產物結構與功效研究。

2015-08-26