肽鈣螯合物的工藝研究

楊文博（黑龍江旅游職業技術學院生物工程系，黑龍江哈爾濱150086）

肽鈣螯合物的工藝研究

楊文博
（黑龍江旅游職業技術學院生物工程系，黑龍江哈爾濱150086）

肽鈣螯合物具有第一代、第二代和第三代鈣制劑都無可比擬的優點，探討最佳肽鈣螯合方法：以螯合率為指標，對干酪素水解肽和鈣螯合工藝進行研究，研究結果表明，最佳的螯合條件為肽鈣質量比為2∶1，pH為8.0，溫度為50℃，時間為40min，此時螯合率為72.78%。螯合率的高低除了以上討論的5個因素之外，也有可能與蛋白質的種類及蛋白質水解產物中肽鏈的長短有關，肽鏈越短，越容易和鈣離子螯合，而本試驗在選擇肽粉時是用復合酶水解的干酪素，這就使蛋白水解液中可能都是小分子肽，所以螯合率較高。

氯化鈣；螯合；多肽

鈣是人體內最重要的礦物質元素之一，是機體維持各項生命活動不可或缺無機元素，它參與人體的新陳代謝，并維持著人體許多細胞的正常運轉工作。但人體對鈣并不能夠全部的吸收，通常有70%～80%不能夠被吸收，而隨著人體的代謝排出體外，主要原因是鈣離子與一些事物中的酸性物質，例如草酸、脂肪酸等形成不溶于水的鹽物質［1］。除此之外，鈣的吸收還與人類年齡、人體的機能狀態有關。

為了提高鈣在人體的吸收利用程度，我國食品行業主要研發了三代鈣制劑產品。第一代鈣制劑產品主要以無機鹽為主，這類鈣制劑產品具有較高的含鈣量，但它消耗了大量的胃酸，引起很大程度的副作用；第二代鈣制劑產品主要以有機酸鹽為主，這類鈣制劑產品需要有維生素D的參與才可完成，而鈣被人體吸收后大量進入血液，導致血清中游離鈣含量的升高，雖說通過維生素D的調節，但穩定系統會使鈣的吸收利用收到抑制；第三代鈣制劑主要是氨基酸螯合鈣，雖說這類鈣制劑彌補了第一代和第二代鈣制劑的不足，但它在螯合機制和轉運方面與多肽螯合鈣相比就存在著一定的缺陷［2］。

1　材料與儀器

肽粉、碳酸鈣（AR）、氧化鈣（AR）、硫酸鈣（AR）、氯化鈣（AR）：天津市本辰方正試劑廠；氫氧化鈣（AR）：天津博迪化工股份有限公司；丙酮（AR）、乙醇（AR）：上海銀典化工有限公司；二硫腙（AR）、茚三酮（AR）：天津市福晨化學試劑廠；真空抽氣泵、FA1004B型電子天平、722S可見分光光度計、PHS-25C型精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；80-1型沉淀離心機：上海手術器械廠；DZKW-8-6型電熱恒溫水浴鍋：北京永光明醫療儀器廠；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

2　方法

2.1肽螯合鈣的試驗設計

干酪素水解肽粉在常溫下不溶于水，因此本試驗設計第一步就是要在加熱的情況下將肽粉溶解，并加入鈣源，在一定溫度、pH和一定時間的條件下將肽鈣螯合，螯合后的產物利用螯合物不溶于有機溶劑中不溶的原理將肽鈣螯合物離心分離、抽濾并干燥得到螯合物的粗制品。

肽鈣螯合工藝流程如下：

干酪素水解肽粉→蒸餾水溶解，并于37℃保溫10 min使其溶解徹底→按比例加入可溶性鈣源→混勻→調節pH→水浴保溫一定時間進行肽鈣的螯合→加入不同體積的有機溶劑沉淀→離心→沉淀洗滌→離心抽濾→鼓風干燥→得干酪素螯合鈣制品［3］。

2.2含鈣物質和有機沉淀劑的選擇

市面上的有機含鈣物質成本費用較高，因此本試驗針對幾種無機含鈣物質［CaCO3、Ca（OH）2、CaO、Ca－SO4、CaCl2］在一些不同濃度的有機溶劑（丙酮、乙醇）和水中的溶解程度進行探討，來確定本試驗最佳鈣源［4］。

2.3單因素試驗設計

以干酪素水解肽螯合鈣的螯合率作為指標，選取以下因素：肽鈣質量比、pH、DH、螯合時間、螯合溫度和乙醇用量進行單因素設計試驗，反應結束后，將螯合物分離純化后，通過測定其螯合率而確定最佳的螯合條件。

鈣含量的測定選擇EDTA滴定法（GB/T 5009.92-2003《食品中鈣的測定》），螯合率的測定公式如下：

螯合率/%=螯合產物中鈣含量/樣品反應物中總鈣含量×100

2.4正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇肽鈣體積比、pH、DH和時間這4個因素進行四因素三水平正交試驗對螯合工藝進行優化，篩選出最佳的螯合工藝，因素水平設定見表1。

表1　因素水平編碼表Table 1　The factor levels of design

3　結果與分析

3.1有機沉淀劑及鈣源的選擇

本試驗在對無機鈣源CaCO3、Ca（OH）2，CaO、Ca－SO4和CaCl2在水中進行溶解比較，除此之外本試驗還針對幾種不同鈣源在不同體積分數的無水乙醇和丙酮溶液中的溶解情況進行試驗而選擇合適的有機沉淀劑。通過試驗比較結果可知氯化鈣在水中、不同濃度的丙酮和乙醇溶液中都有較高的溶解度，這就有利于肽鈣螯合反應的進行，也有利于肽鈣螯合物和游離鈣的分離，因此本試驗選擇氯化鈣為最佳的鈣源。

3.2單因素試驗設計的結果與分析

3.2.1肽鈣比對肽鈣螯合率的影響

配位體與金屬離子的質量比是影響配位螯合反應的一個重要因素，配位比過高，會使多肽的利用率下降，不經濟；配位體過低，螯合物不穩定。因此，本試驗針對不同配位比下的螯合反應進行了研究，確定最佳的配位比。

將干酪素水解多肽與CaCl2按質量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1進行混合，調節pH8.0，充分攪拌使其均勻，在50℃下水浴保溫40 min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，試驗結果見圖1。

圖1　 肽鈣質量比對螯合率的影響Fig.1　The effects of peptide calcium quality on chelating rate

從圖1可以看出，質量比對螯合率影響很大，當肽鈣質量比達到2∶1～3∶1時，反應體系中螯合率比較平緩，并達到最大值，隨后，隨著質量比的增加，螯合率反而下降，因此，本試驗證明肽鈣質量比為2∶1～3∶1為螯合最佳的肽鈣配位比。

3.2.2pH值對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質量比3∶1進行混合，調節不同的pH進行試驗（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），在50℃下水浴保溫40min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率［4］，選擇最佳的pH，結果見圖2。

從圖2可以看出，產品的螯合率隨著pH的升高而增大，到后來慢慢的趨于平緩，在堿性條件下的肽鈣的螯合率明顯高于酸性條件。當pH小于8.0時，肽鈣的螯合率不高，當pH在8.0～10.0之間時，肽鈣螯合率比較平緩，不會下降，但是堿性過強，而且產生的氫氧化鈣沉淀，這些都會使產物產生一種不愉快的堿味，所以經本試驗驗證，肽鈣螯合的最佳pH為8.0～9.0。

圖2　pH對螯合率的影響Fig.2　The influence of pH value of chelating rate

3.2.3溫度對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質量比3∶1進行混合，調節pH8.0，充分攪拌使其均勻，分別在不同溫度下水浴保溫40 min（20、30、40、50、60℃），之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，選擇最佳的螯合溫度，試驗結果見圖3。

圖3　 溫度對螯合率的影響Fig.3　The influence of temperature on the chelating rate

從圖3可以看出，螯合率隨著溫度值的升高先增大后減小，在30℃～50℃時，螯合率明顯呈上升的趨勢，但當溫度高于50℃時，肽鈣螯合率將明顯下降。說明溫度過高不利于螯合反應的進行，升高溫度可能會使蛋白質變性或使螯合物分解，也可能產生其他的反應。由此可見，螯合的最佳溫度是50℃左右。

3.2.4時間對肽鈣螯合率的影響

將干酪素水解多肽與CaCl2按質量比3∶1進行混合，調節pH8.0，充分攪拌使其均勻，在50℃溫度下水浴保溫20、30、40、50、60 min，之后加入8倍體積的無水乙醇，離心，抽濾，鼓風干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，選擇最佳的螯合時間，試驗結果見圖4。

由圖4可以看出，隨著時間的延長，螯合率是先增大后減小，在40 min時，肽鈣的螯合率最大。有些文獻報道，時間對螯合反應沒有多大的影響，但本試驗經過研究發現，隨著時間延長，螯合率的走勢呈拋物線的形狀，這說明肽鈣螯合物的生成是通過吸附反應發生著動態的吸附和解析的過程，在反應前期，吸附反應大于解析反應，肽鈣進行著螯合，隨著時間的延長，解析反應占主導，這就不利于肽鈣的螯合，在40 min時，這種吸附解析過程達到了動態的平衡。因此，肽鈣螯合的最佳時間是40 min。

圖4　時間對螯合率的影響Fig.4　The effects of time on chelating rate

3.2.5沉淀劑用量對肽鈣螯合率的影響

用無水乙醇沉淀分離螯合物時，沉淀劑的用量對產物的得率有一定的影響。因此，本試驗將干酪素水解多肽與CaCl2按質量比3∶1進行混合，調節pH8.0，充分攪拌使其均勻，在50℃溫度下水浴保溫40 min之后，分別加入一定體積的無水乙醇（體系中乙醇濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%）沉淀螯合物，離心，抽濾，鼓風干燥得肽鈣螯合物，測其螯合率，確定最佳的沉淀劑用量，試驗結果見圖5。

圖5　無水乙醇濃度對螯合率的影響Fig.5　The effects of anhydrous ethanol concentration on chelating rate

從圖5可以看出，當無水乙醇的濃度低于80%時，隨著無水乙醇的加入，螯合率有明顯的增加，但是當乙醇濃度達到80%時，繼續增加無水乙醇的用量，螯合率的變化不大。說明加入無水乙醇的量不足的話，乙醇會被溶液中的水稀釋，一定量的螯合物會溶解到乙醇-水溶液中，造成螯合物的損失；所以無水乙醇的加入量越多，螯合物分離的效果越好，但是，當無水乙醇加到一定量的時候，在繼續加入無水乙醇，螯合物的得率不再變化，如果此時在繼續加入乙醇，勢必會造成不必要的浪費。綜上所述，沉淀劑無水乙醇的用量最好的是80%即可。

3.3正交試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，選擇肽鈣質量比、pH、干酪素水解度和螯合時間這4個因素進行四因素三水平的正交試驗，根據試驗結果對螯合工藝進行優化，刪選出最佳肽鈣螯合條件。

干酪素水解多肽螯合鈣正交優化試驗結果見表2。

表2　正交試驗結果Table 2　The results of orthogonal experiment

由表2可知，肽鈣比、pH、螯合溫度、螯合時間對肽鈣螯合率均有影響，影響的次序依次為肽鈣比＞pH值＞螯合溫度＞螯合時間，最佳組合條件為A1B2C2D2，即肽鈣質量比為2∶1、pH為8.0，螯合溫度為50℃，螯合時間為40 min，此時多肽螯合鈣的螯合率為72.78%。

根據正交試驗結果進行正交試驗方差分析，找出影響肽鈣螯合的極顯著因素和顯著因素，正交試驗方差分析表見表3。

表3　 正交試驗方差分析表Table 3　Orthogonal experiment anova table

從表3方差分析結果可知，肽鈣比對螯合率影響最大，呈極顯著水平，pH對肽鈣螯合率的影響次之，呈顯著水平。

4　結論

在肽鈣螯合鈣制品工藝研究中，通過選擇合適的鈣源，嚴格控制肽鈣質量比、溫度、pH和時間這些螯合條件，選擇無水乙醇作為有機沉淀劑，分離沉淀肽鈣制品，本課題通過單因素試驗和四因素三水平正交試驗，確定最佳螯合工藝為鈣源選擇為氯化鈣，有機沉淀劑為無水乙醇且無水乙醇的用量為80%，肽鈣質量比為2∶1，pH為8.0，螯合溫度為50℃，時間為40 min，這就得到螯合率為72.78%的肽鈣螯合制品。

［1］于平，勵建榮.補鈣劑的現狀及營養評價方法［J］.中國食品學報，2002，2（1）：57-61

［2］曾敏莉，周遠大.鈣制劑的現狀及發展趨勢［J］.兒童藥學雜志，2004，10（3）：16-18

［3］孫莉潔，梁金鐘.響應面法優化大豆肽與鈣離子螯合的研究［J］.中國糧油學報，2010，25（1）：22-27

［4］原龍，王新.牛奶中酪蛋白和乳糖的分離方法研究［J］.應用化工，2009，38（3）：389-394

Study on the Process of Peptide Calcium Chelate

YANG Wen-bo
（Department of Biological Engineering，Heilongjiang Vocational College of Tourism，Harbin 150086，Heilongjiang，China）

Calcium peptide chelate has at present，the first generation，second and third generation calcium preparations are incomparable advantages，this topic discusses the best method of peptide chelate calcium：with the aojiang rate as index，hydrolysis of casein peptide and calcium aojiang process was studied，the results showed that，the best aojiang eligible for peptide calcium quality ratio of 2∶1，pH 8.0，temperature of 50℃，time of 40 min，the rock at a rate of 72.78%.Rock and rate of five factors in addition to the above discussion，it is also possible and the types of protein and protein hydrolysate in the length of the peptide chain，the shorter the peptide chain，the easier and calcium aojiang，and this study choose the casein hydrolysis enzyme is a complex enzyme，this makes may be small molecular peptide protein hydrolysate，so the aojiang rate is higher.

calciumchloride；chelate；polypeptide

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.034

楊文博（1983—），女（漢），中級講師，碩士，研究方向：食品檢驗檢測。

2015-08-19