葡萄籽蛋白脫色試驗研究

年賀鳳，朱桂花，韋萌萌，馬帥，黃梅（北方民族大學化學與化學工程學院，寧夏銀川750021）

葡萄籽蛋白脫色試驗研究

年賀鳳，朱桂花*，韋萌萌，馬帥，黃梅
（北方民族大學化學與化學工程學院，寧夏銀川750021）

以寧夏葡萄籽為原料，采用堿溶酸沉淀法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，對其脫色方法進行研究。通過比較活性炭及雙氧水的脫色效果，確定了以雙氧水為脫色劑的試驗方法。結果表明，脫色時白度和產率的控制條件相互制約，需綜合考慮實際需求選擇脫色條件。經過正交試驗優化并綜合考慮白度和產率兩項指標，當固液比為1∶25（g/mL）時，確定pH8.0、雙氧水用量15 mL、脫色溫度55℃、脫色時間40 min為最適脫色條件，該條件下脫色蛋白產率為78.21%，白度為14.71。

葡萄籽；蛋白；脫色；白度

我國是葡萄生產大國，每年的產量約有500多萬t，葡萄釀酒、果汁加工過程中產生的下腳料主要是葡萄皮和葡萄籽，其中葡萄籽約占鮮果的4%～7%產量可觀。目前，曾經作為廢棄物的葡萄籽受到廣泛關注，葡萄籽油、葡萄籽原花青素的提取和應用已逐步實現產業化，市場上相關的高附加值產品層出不窮。葡萄籽榨油后的餅粕及提取原花青素后剩余物中含有12%～16%蛋白，其中包含谷氧酸、甘氨酸、丙氨酸等18種氨基酸，人體必需的8種氨基酸俱全，而擷氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相當于大豆蛋白中的含量，是優質的蛋白質資源，極具開發潛力［1-2］。葡萄籽及其餅粕中的蛋白主要作為動物飼料得以簡單利用，且相關研究主要集中在蛋白的提取方面［3-5］，相信隨著對葡萄籽蛋白研究的不斷深入，這種優質的蛋白資源將在食品、保健、特種飼料等方面大有作為，市場潛力巨大。

葡萄籽中含有大量色素，通過預處理后提取出的粗蛋白呈現褐色，有必要進行脫色以利于進一步的開發和利用。目前，實驗室中對植物蛋白脫色常用的方法包括有機溶劑脫色法、活性炭脫色法、雙氧水脫色法［6］。有機溶劑脫色法是利用蛋白質及脂類等雜質在溶劑中的溶解度不同實現脫色，肖海峻［7］等以無水乙醇為浸提劑對苜蓿葉蛋白脫色脫腥工藝參數進行了研究，但需要3級浸提才有理想的效果，過程較繁瑣。活性炭表面的微孔結構使其對多數有機物質具有較強的吸附能力，陸晨［8］研究了活性炭對茶渣中蛋白的脫色性能，脫色率達90%時蛋白質損失率超過60%，說明活性炭對茶渣蛋白有較強的吸附作用。雙氧水是一種無色透明的液體氧化劑，可使植物粗蛋白中的有色物質氧化分解，脫色效果明顯而且自身無殘留，安全性較高。羅倉學［9］比較了次氯酸鈉、亞硫酸鈉、雙氧水3種不同的脫色劑對甘薯糖蛋白粗提物的脫色效果，表明雙氧水的脫色性能更優。葡萄籽蛋白的脫色研究鮮有報道，本研究從實際應用及安全性出發，比較了活性炭與雙氧水對葡萄籽粗蛋白的脫色效果，通過單因素及正交試驗優化了脫色試驗條件，為葡萄籽蛋白的開發利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

葡萄籽：寧夏紅釀酒廠；氫氧化鈉、濃鹽酸、石油醚、濃硫酸、硼酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅-溴甲酚氯指示劑：均為分析純試劑。粉末狀活性炭（200目～300目）、30%雙氧水：工業食品級。

1.2儀器設備

KA-1000離心機：上海安亭科學儀器廠；78-1磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；PHS-3C精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；FA-1004N型電子天平：上海光正醫療儀器有限公司；SF-130型高速中藥粉碎機：長沙市岳麓區中南制藥機械廠；101FAB-3型電熱鼓風干燥箱：上海電光儀器儀表有限公司；WSB-1白度儀：上海昕瑞儀器儀表有限公司；半微量凱式定氮儀：上海洪紀儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1葡萄籽粗蛋白的提取

葡萄籽粉碎并過60目篩，用石油醚以1∶2（g/mL）的料液比浸泡24 h進行脫脂。脫脂葡萄籽粉與0.10 mol/L NaOH溶液以1∶25（g/mL）的料液比混合，于40℃水浴攪拌加熱30 min，冷卻至室溫離心分離，取上清液加入4 mol/L HCl溶液等電點沉淀。抽濾，取濾渣，置于50℃烘箱中5 h。干燥后研缽粉碎，得葡萄籽蛋白粗品，以脫脂葡萄籽為基準計算產率，測定蛋白含量。

1.3.2蛋白含量測定

采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定葡萄籽蛋白含量。

1.3.3葡萄籽粗蛋白脫色效果檢測

葡萄籽粗蛋白及脫色蛋白經干燥、研磨后測定白度。

1.3.4活性炭及雙氧水脫色效果比較試驗

1.3.4.1活性炭脫色

向三角瓶中加入4.00 g葡萄籽粗蛋白及0.10 mol/L NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質溶解，加入活性炭粉末置于水浴中攪拌加熱30 min，趁熱抽濾，濾液冷卻至室溫后滴加4 mol/L HCl溶液至等電點，抽濾后的濾渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研缽粉碎得脫色葡萄籽蛋白，以粗蛋白為基準計算產率，測定白度及蛋白含量。

1.3.4.2雙氧水脫色

向三角瓶中加入4.00g葡萄籽粗蛋白及0.10mol/L NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質溶解，加入雙氧水置于水浴中攪拌加熱進行脫色，溶液冷卻至室溫后滴加4 mol/L HCl溶液至等電點，抽濾后的濾渣置于50℃烘箱中干燥5 h，研缽粉碎得脫色葡萄籽蛋白，以粗蛋白為基準計算產率，測定白度及蛋白含量。

1.3.5萄籽粗蛋白脫色單因素試驗

以溶液pH、脫色劑用量、脫色時間、脫色溫度為考察因素，以脫色后葡萄籽蛋白的白度及蛋白產率為衡量標準，確定各單因素對脫色效果的影響規律。

1.3.5.1溶液pH的影響

在雙氧水用量為20 mL、脫色溫度65℃、脫色時間40 min的條件下，溶液pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5時進行單因素試驗，根據脫色后蛋白白度及產率確定較優的pH。

1.3.5.2脫色劑用量的影響

在pH為8.0、脫色溫度65℃、脫色時間40 min的條件下，雙氧水用量分別為5、10、20、30、40、50、60 mL時進行單因素試驗，根據脫色后蛋白白度及產率確定較優的脫色劑用量。

1.3.5.3脫色溫度的影響

在pH為8.0、雙氧水用量為20 mL、脫色時間為40 min的條件下，脫色溫度分別為40、50、60、70、80℃時進行單因素試驗，根據脫色后蛋白白度及產率確定較優的脫色時間。

1.3.5.4脫色時間的影響

在pH為8.0、雙氧水用量為20 mL、反應溫度50℃的條件下，脫色時間分別為20、30、40、50、60 min時進行單因素試驗，根據脫色后蛋白白度及產率確定較優的脫色時間。

1.3.6正交試驗

優化脫色條件，在單因素試驗的基礎上，通過L9（34）正交試驗應進一步優化試驗條件，設計的因素水平見表1。

表1　 正交試驗因素及水平表Table 1　The factors and levels of the orthogonal test

1.3.7驗證試驗

在正交試驗所確定的最優脫色條件下進行5次平行試驗，以驗證脫色方法的穩定性及可靠性。

2　結果與分析

2.1活性炭及雙氧水脫色效果的比較

本試驗采用堿溶酸沉法提取的脫脂葡萄籽粗蛋白呈紫褐色，粗蛋白產率48.06%，白度為3.07，凱氏定氮法測定蛋白含量為50.47%。活性炭及雙氧水因脫色后無殘留而具有較高的安全性，但二者的脫色原理不同。活性炭比表面積大，通過物理吸附進行脫色，其來源廣、價格低，對有色物質的吸附能力在酸性溶液較強［10-11］，但吸附選擇性不高。H2O2是強氧化劑，通過對色素分子中的生色基的共軛雙鍵能產生破壞作用而脫色，自身易分解為水和氧氣，對環境及樣品無污染，其氧化能力在堿性條件下更強但穩定性較差。本試驗采用工業食品級活性炭及雙氧水分別進行脫色試驗，結果（見表2）表明：活性炭對葡萄籽粗蛋白吸附性強，脫色的選擇性較差，不適合做脫色劑；雙氧水脫色效果相對較好，由于葡萄籽蛋白只能在堿性條件下溶解后才可進行脫色，雙氧水氧化性增強穩定性降低，表現出使用量較大且對蛋白有一定的破壞作用，因此需進一步優化脫色條件。

表2　活性炭及雙氧水脫色試驗結果比較Table 2　The result of activated carbon and hydrogen peroxide decolorizing test

2.2不同單因素對脫色效果的影響

2.2.1pH的影響

pH對脫色蛋白產率及白度的影響結果見圖1。

圖1　pH對葡萄籽粗蛋白脫色效果的影響Fig.1　Effect of pH on decolorization efficiency of grape seed crude protein

結果表明，隨著pH的增大，蛋白產率呈下降趨勢，白度則先增大后降低，pH為8.0時白度最大。雙氧水氧化能力隨溶液堿性增大而提高，導致對蛋白的破壞作用隨pH的升高而增強，使蛋白產率隨之下降，pH大于8.5時蛋白產率下降尤其明顯。白度的變化則說明pH在一定范圍內雙氧水以破壞色素為主，但堿性過強導致以蛋白的氧化破壞作用為主而產生較多有色產物，從而使白度降低。綜合考慮白度和產率的變化情況，溶液的pH應控制在8.0附近。

2.2.2脫色劑用量的影響

脫色劑用量對脫色蛋白產率及白度的影響結果見圖2。

結果表明，隨著雙氧水用量的增加，蛋白產率呈下降趨勢，白度則先增大后降低，說明雙氧水在脫色時對蛋白也造成了破壞。雙氧水用量在10 mL至20 mL之間時蛋白產率變化不大，之后下降明顯。雙氧水用量在10 mL至40 mL之間時白度的增加緩慢，用量為40 mL時白度最大。綜合考慮白度和產率的變化情況，雙氧水用量控制在20 mL左右較為合適。

圖2　脫色劑用量對脫色蛋白產率及白度的影響Fig.2　Effect of amounts of decolorizing agents on decolorization efficiency of grape seed crude protein

2.2.3脫色溫度的影響

脫色溫度對脫色蛋白產率及白度的影響結果見圖3。

圖3　溫度對葡萄籽蛋白脫色效果的影響Fig.3　Effect of different temperature on decolorization efficiency of grape seed crude protein

由圖3可知，隨著脫色溫度的升高，脫色蛋白的白度提高而產率下降。試驗發現，脫色溫度達80℃時溶液稠度明顯增加，而脫色溫度高于60℃時蛋白產率下降尤為明顯，說明溫度的升高在促進脫色的同時對蛋白的破壞作用也在增強。綜合考慮白度和產率的變化情況，脫色溫度應控制在50℃～60℃的范圍內。

2.2.4脫色時間的影響

脫色時間對脫色蛋白產率及白度的影響結果見圖4。

圖4　脫色時間葡萄籽蛋白脫色效果的影響Fig.4　Effect of different time on decolorization efficiency of grape seed crude protein

結果表明，隨著反應時間的增加，葡萄籽蛋白的脫色效果逐漸增加，白度提高，脫色蛋白產率下降。脫色時間40 min以后，隨時間的增加白度急劇增加的同時蛋白產率亦急劇下降，說明達到一定脫色時間時，雙氧水脫色及對蛋白的破壞作用幾乎同時加強，因此在應用時可根據具體需求控制脫色時間。本試驗綜合考慮白度和產率的變化趨勢，控制脫色時間在30 min～40 min可獲得較為穩定的產率和白度。

2.3正交試驗結果

通過單因素試驗發現，脫色葡萄籽蛋白的白度與其產率基本成反比關系，但各因素對二者的影響規律又有差異，說明單因素之間存在著相互影響，為了進一步優化脫色條件，根據單因素試驗結果設計了L9（34）正交試驗（見表1），試驗結果見表3。

白

度

表3　葡萄籽蛋白脫色正交試驗結果Table 3　Result of decolorization of grape seed crude protein orthogonal test

由表3可知，在正交試驗的條件下，各因素對葡萄籽蛋白脫色產率的影響主次為A＞B＞D＞C，最佳組合為A2B1C3D2；對脫色蛋白白度的影響主次為B＞C＞D＞A，最佳組合為A3B3C2D3。從各因素極差的相對大小可以看出：脫色時溶液pH及雙氧水用量對產率影響較大，脫色溫度及脫色時間影響較小；脫色時雙氧水用量對白度影響較大，pH影響較小。從二者最佳組合的組成來看，脫色條件較溫和時產率較高，脫色條件劇烈時白度較高，說明采用雙氧水對葡萄籽蛋白進行脫色時白度和產率的控制條件相互制約，需綜合考慮實際需求選擇脫色條件。本試驗綜合考慮白度和產率兩相指標，選擇正交試驗的第4組方案（A2B1C2D3）為較佳的組合，即pH為8.0、雙氧水用量為15 mL、脫色溫度為55℃、脫色時間為40 min，此條件下脫色蛋白產率為78.21%，白度為14.71。

2.4驗證試驗

在5個三角瓶中分別稱取4.00 g葡萄籽粗蛋白，0.10 mol/L的NaOH溶液，料液比為1∶25（g/mL），混合攪拌使蛋白質溶解后加入15 mL雙氧水，將溶液pH調整到8.0，料液比為1∶25（g/mL）置于水浴中55℃攪拌加熱40 min，5次平行試驗結果見表4。

表4　 驗證試驗及結果Table 4　Validation test and the result

結果表明，用雙氧水對葡萄籽粗蛋白進行脫色的蛋白產率及白度平均值分別為77.88%和14.98，變異系數分別為0.51%和1.7%，試驗數據具有較好的重現性，說明該方法穩定可靠。

2.5結論

采用堿溶酸沉法提取的葡萄籽粗蛋白呈紫褐色白度為3.07，蛋白含量為50.47%。通過工業食品級活性炭及雙氧水的脫色比較試驗發現，雙氧水脫色效果相對較好，且條件溫和、操作簡單、對環境無污染，可作為葡萄籽粗蛋白脫色的參考方法。試驗表明，脫色時白度和產率的控制條件相互制約，脫色條件較溫和時產率高白度低，脫色條件劇烈時白度較高而產率較低，需綜合考慮實際需求選擇脫色條件。經過正交試驗優化并綜合考慮白度和產率兩項指標，本試驗選擇pH8.0、雙氧水用量15 mL、脫色溫度55℃、脫色時間40 min為最適脫色條件，該條件下脫色蛋白產率為78.21%，白度為14.71。

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Study on Decolorization of Grape-seed Crude Protein

NIAN He-feng，ZHU Gui-hua*，WEI Meng-meng，MA Shuai，HUANG Mei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Grape-seed crude protein which was purple brown in color was extracted from the Ningxia local grape seed used as raw material，by an alkali-solution and acid-isolation method.Herein，the decolorization of crude protein was studied.A bleaching method with H2O2as a kind of decolorant was finally selected through comparing the bleaching effects with active carbon and H2O2.The results showed that in bleaching，the conditions for whiteness and yield were restricting each other.Therefore，the bleaching conditions must be selected by comprehensively considering the actual demands.The optimum bleaching conditions were found by the singlefactor and orthogonal experiments and with the two aspects of whiteness and yield in consideration.The optimum conditions were that the solid-liquid ratio was 1∶25（g/mL），pH was 8.0，the quantity of H2O2was 15 mL，the bleaching time was 40 min，and the bleaching temperature was 55℃.The decolorized grape seed protein with a whiteness of 14.71 was produced under the optimum conditions，and the yield of the decolorized grape seed protein was 78.21%.

grapeseed；protein；decolorization；whiteness

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.004

國家級大學生創新實驗項目（201411407035）

年賀鳳（1993—），女（漢），本科生，制藥工程專業。

朱桂花（1964—），女（漢），教授，碩士，研究方向：化學工藝。

2015-08-21