響應面法優化水提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛，彭太兵，符秋霞，郭姝瓊，劉喜情（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學院生物與食品工程學院，湖南懷化418008）

響應面法優化水提地瓜藤中總黃酮工藝

徐君飛，彭太兵，符秋霞，郭姝瓊，劉喜情
（民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，懷化學院生物與食品工程學院，湖南懷化418008）

利用響應面法優化水提地瓜藤中總黃酮工藝條件，提高總黃酮得率。在單因素試驗、Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，以總黃酮提取量為響應值，利用響應面法研究各因素及其交互作用對地瓜藤中總黃酮提取量的影響，優選提取工藝。水提地瓜藤中總黃酮最佳工藝條件為：料液比1∶50（g/mL），浸提前浸泡50 min，60℃，浸提50 min，在此工藝條件下，地瓜藤中總黃酮的提取量為25.62mg/g。

地瓜藤；總黃酮；水提；響應面法

地瓜藤（Ficus Tikoua Bur.）系桑科榕屬植物地瓜的全草，又稱霜坡虎、爬地牛奶、鉆地龍，味苦、性寒，主要分布于廣西、貴州、湖南等地，為苗族常用藥材，含有豐富的氨基酸、礦物質、黃酮類化合物，具有清熱利濕、活血通絡、解毒消腫等作用［1］。

黃酮（flavonoids）是一類具有2-苯基色原酮結構化合物，廣泛存在于植物體內，是許多食品和中藥材的有效成分，有抗菌、抗病毒、降糖、降血脂、免疫調節等作用［2-4］。

在傳統應用過程中，熱水是地瓜藤中黃酮提取的最佳溶劑，具有操作簡便、成本低廉的優勢，作者首次采用非線性數學模型擬合的方式，對水提地瓜藤中總黃酮的工藝條件進行優化，旨在為其試驗研究和工業應用提供參考和依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

地瓜藤：種植于懷化學院生物園，干燥至恒重，粉碎備用；蘆丁（色譜純）：北京德威鈉生物技術有限公司；其它藥品均為分析純。

FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機：Eppendorf公司；UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.2方法

1.2.1地瓜藤中總黃酮提取［5］

精確稱取2.00 g地瓜藤粉于100 mL燒杯，加入60 mL蒸餾水，室溫攪拌浸泡30 min，升溫至70℃攪拌浸提30 min，冷卻，10 000 r/min離心3 min，收集濾液于100 mL容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度，得樣品液。

1.2.2單因素試驗

采用單因素試驗，依次優化料液比、浸提前浸泡時間、浸提溫度、浸提時間等參數［6-7］。

1.2.3Plackett-Burman（PB）試驗［8］

在單因素試驗基礎上，以總黃酮提取量為響應值，采用Design-Expert 8.0.6［9］進行二級水平（低水平“-1”，高水平“1”）PB試驗［10］優化料液比（A）、浸提前浸泡時間（B）、浸提溫度（C）、浸提時間（D）、浸提次數（E）5個因素，篩選出對試驗結果影響顯著的因素［11］。PB試驗因素水平編碼見表1。

表1　PB試驗因素水平編碼Table 1　Range and factors of PB design

1.2.4最陡爬坡試驗

PB試驗通常只能分析各因素對試驗結果影響的大小，而不能確定最優點所在的區域［12］，因此根據PB試驗結果，采用最陡爬坡試驗來尋找料液比（A），浸提前浸泡時間（B），浸提時間（D）的最優點所在區域。

1.2.5中心組合設計（Central Composite Design，CCD）試驗

CCD試驗可用來評價試驗指標與各因素之間一階、二階或交互作用的非線性關系［13］。在單因素試驗、PB試驗、最陡爬坡試驗的基礎上，選取料液比（A），浸提前浸泡時間（B），浸提時間（D）3個對地瓜藤中總黃酮提取量影響顯著的因素，采用Design-Expert 8.0.6進行三因素五水平CCD試驗設計，試驗因素水平編碼見表2。

表2　CCD試驗設計因素水平編碼Table 2　Range and factors of CCD

1.3分析檢測方法

采用分光光度法繪制蘆丁標準曲線。以蘆丁質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線并建立回歸方程，A=4.582 9c-0.012 5，R2= 0.999 1。

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1浸提溫度對總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同浸提溫度對提取量的影響，結果見圖1。

圖1　浸提溫度對總黃酮提取量的影響Fig.1　Fffect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

由圖1可知，溫度由40℃升高至60℃，總黃酮提取量不斷增大，當溫度為60℃時，總黃酮提取量最大，達19.8 mg/g；繼續升溫，提取量不升反而快速下降，這可能是由于浸提溫度過高，影響黃酮的穩定性，使其受熱分解，且隨著浸提溫度的升高，雜質溶出量加大，增加后續目標物質純化的難度［14］。因此，選擇60℃作為后續試驗的參考值。

2.1.2料液比對總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同料液比對提取量的影響，結果見圖2。

圖2　料液比對總黃酮提取量的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖2可知，總黃酮提取量隨料液比增大而增大，但當料液比超過1∶35（g/mL），總黃酮的提取量增長緩慢，這可能是由于地瓜藤在料液比為1∶35（g/mL）時，總黃酮的溶出量已趨于飽和，且過高的液相濃度會提高生產成本和后續濃縮難度［15］。因此，選用料液比1∶35（g/mL）作為后續試驗的參考值。

2.1.3浸提前浸泡時間對總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察浸提前浸泡不同時間對提取量的影響，結果見圖3。

圖3　浸提前浸泡時間對總黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of soak time before extract on extraction yield of total flavonoids

由圖3可知，總黃酮提取量隨浸提前浸泡時間的延長而增大，但當浸泡時間超過30 min，總黃酮的提取量增長緩慢。這可能是由于地瓜藤在室溫浸泡30 min時，總黃酮的溶出量趨于飽和［16］，且延長浸泡時間，影響提取的時效性，因此，選用浸提前浸泡30 min作為后續試驗的參考值。

2.1.4浸提時間對總黃酮提取量的影響

按照方法1.2.1，其它因素條件不變，考察不同浸提時間對提取量的影響，結果見圖4。

圖4　浸提時間對總黃酮提取量的影響Fig.4　Fffect of extract time on extraction yield of total flavonoids

由圖4可知，浸提時間由20 min延長至40 min，總黃酮的提取量不斷增大，當浸提時間為40 min時，總黃酮的提取量達到最大，為22.6 mg/g，繼續延長浸提時間，提取量不升反而快速減小，這可能是由于總黃酮在長時間高溫條件下結構破壞、分解，且長時間高溫浸提耗能大，雜質溶出量大［17］，因此，選用浸提40 min作為后續試驗的參考值。

2.2PB試驗

按照PB試驗設計，共進行12次試驗，其中6個空白因素［18］，每個試驗號重復3次，取均值，試驗方案及結果見表3。

表3　PB試驗設計及響應值Table 3　PB test design and result

用Minitab l7［19］對表3中結果進行回歸模型方差分析，結果見表4。

由表4可知，此次試驗所得到的回歸擬合方程顯著（模型項P＜0.05），具有統計學意義。R2=0.996，R2（調整）=0.993，說明變異可以用模型來解釋。回歸方程系數顯著性檢驗見表5。

表4　 回歸模型方差分析Table 4　Analysis of variance of regression equation

表5　偏回歸系數及顯著性檢驗表Table 5　Partial regression coefficients and significance test

由表5可以看出，回歸得到多元一次方程為Y= 18.46+0.99A+3.76B-0.08C+0.64D+0.08E，且影響提取量的主要因素為料液比（A）、提取前浸泡時間（B）、提取時間（D）。

2.3最陡爬坡試驗

根據PB試驗，對A、B、D三因素進行最陡爬坡試驗，以試驗值的變化方向為爬坡方向，根據各因素效應值與比例來確定變化步長［20］。根據表5中因素估計系數，A、B、D三因素皆為正效應，變化值依次增大。最陡爬坡試驗設計和結果如表6。

表6　最陡爬坡試驗設計及結果Table 6　Experimental design and results of steepest ascent path

從表6可知，隨著爬坡的進行，Y值增加，在處理4處即達到最高點，之后又開始下降，說明在該點對應的條件值時，總黃酮提取量接近了最優點，因此選擇這一點作為中心組合設計的中心點。

2.4CCD試驗

2.4.1CCD試驗設計及結果

選取A、B、D三因素，做三因素五水平響應面分析，共設計20個試驗點，其中，6個中心點（以最陡爬坡試驗的最優值為中心點［21］），14個析因點，設計方案及結果見表7。

表7　CCD試驗設計方案及響應值Table 7　Experiment design and result of CCD

2.4.2回歸模型方差分析

利用Design expert 8.0.6對表7數據進行回歸擬合，得回歸方程：Y=24.30+0.43A+1.05B+0.50D-0.075AB+0.075AD+0.075BD-0.11A2-0.29B2-0.29D2。該模型系數顯著性檢驗見表8所示，模型的方差分析結果如表9所示。

表8　回歸系數顯著性檢驗表Table 8　Significance test table of regression coefficient

表9　 回歸方程方差分析Table 9　Analysis of variance of regression equation

由表8可知，在一次項、二次項中，料液比（A）、浸提前浸泡時間（B）、浸提時間（D）對總黃酮的提取量的影響都達到了顯著水平。

從表9中回歸方程的方差分析可知，F=134.76＞F0.01（9，5），相應的概率值P＜0.000 1，該方程模型達到極其顯著。失擬性檢驗分析得失擬不顯著，表明該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好地擬合。通過對試驗模型可信分析，得到相關系數R2為0.935 0，說明模型可以解釋93.5%試驗所得總黃酮含量的變化，表明方程擬合較好。校正后R2為0.984 5，表明總黃酮提取量98.45%的變異分布在方程中，其總變異中僅有1.55%不能由該模型解釋。總黃酮提取量（Y）的變異系數較低（0.58），表示試驗的精確度高，試驗可靠性強，試驗操作可信。綜上所述，回歸方程給總黃酮的提取提供了一個合適的模型。

2.4.3響應曲面的擬合以及最優條件的確定

圖5～圖7是由多元二次回歸方程所作的各因素之間兩兩相互作用對響應值的影響所得到的響應面圖及等高線圖。

圖6　Y=f（A，D）的響應面圖和等高線圖Fig.6　Response surface and contours of Y=f（A，D）

圖7　Y=f（B，D）的響應面圖和等高線圖Fig.7　Response surface and contours of Y=f（B，D）

由此可見，響應值隨料液比（A）、浸提前浸泡時間（B）、浸提時間（D）的增大呈先增后降的趨勢，說明3個因素在所選范圍內能產生較佳的響應值。

2.5最佳工藝參數及驗證試驗

通過Design expert 8.0.6優化的工藝條件為：料液比為1∶50（g/mL），浸提前浸泡時間50 min，浸提溫度60℃，浸提時間50 min，浸提次數1次，此時總黃酮的理論提取量為25.66 mg/g。為檢驗響應面法優化結果的可靠性，采用上述優化條件提取地瓜藤中總黃酮，進行3次平行試驗，結果表明，在此條件下，地瓜藤中總黃酮的平均提取量為25.62 mg/g，與預測值相符，說明此方程與實際情況擬合良好，因此基于響應面法分析所得的優化提取工藝參數準確可靠，具有實際參考價值。

3　結論

通過單因素試驗、PB試驗、最陡爬坡試驗、CCD試驗對水提地瓜藤中總黃酮工藝條件進行優化，得出最佳提取工藝條件為：料液比為1∶50（g/mL），浸提前浸泡50 min，浸提溫度60℃，浸提50 min，浸提1次，在此工藝條件下，總黃酮提取量為25.62 mg/g。

地瓜藤的開發進度緩慢，已經造成了大量資源浪費，對于其中活性成分的深入研究，必定為地瓜藤的開發研究提取基礎理論數據和參考依據。地瓜藤的廣泛開發應用，前景廣闊，可大大推動地方經濟發展，產生更大的經濟效益與社會效益。

［1］郭良君，譚興起，鄭巍，等.地瓜藤化學成分研究［J］.中草藥，2011，42（9）：1709-1711

［2］Bi W，Tian M，Row KH.Evaluation of alcohol-based deep eutectic solvent in extraction and determination of flavonoids with response surface methodology optimization［J］.J Chromatogr A，2013，1285（4）：22-30

［3］Liu C，Qin K，Qi Y，et al.Optimization of ultrasonic extraction of total flavonoids from Tussilago farfara L.using response surface methodology［J］.Pharmazie，2014，69（4）：311-315

［4］曹春艷.響應面法優化銀杏葉黃酮提取工藝［J］.中國食品學報，2014（4）：78-86

［5］陳瑛，孫興力，王文淵.紅薯葉中黃酮類化合物的超臨界提取研究［J］.廣州化工，2011，39（6）：82-84

［6］Tang B，Lee YJ，Lee YR，et al.Examination of 1-methylimidazole series ionic liquids in the extraction of flavonoids from Chamaecyparis obtuse leaves using a response surface methodology［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，933（8）：8-14

［7］杜娟，崔瑞峰.紅薯莖葉中黃酮類化合物的提取工藝［J］.食品工程，2013（3）：21-23

［8］顧英，韓鳳麗，王洪洋.響應面法優化紅薯葉類黃酮提取工藝的研究［J］.食品工業科技，2012，33（3）：286-289

［9］陳況況，帕塔爾，尼牙孜，等.響應面法優化水芹黃酮提取工藝及其成分研究［J］.中國食品學報，2014（11）：83-89

［10］Ma F，Zhao Y，Gong X，et al.Optimization of quercitrin and total flavonoids extraction from Herba Polygoni Capitati by response surface methodology［J］.Pharmacogn Mag，2014，10（Suppl 1）：S57-64

［11］Liu Y，Wang H，Cai X.Optimization of the extraction of total flavonoids from Scutellaria baicalensis Georgi using the response surface methodology［J］.J Food Sci Technol，2015，52（4）：2336-2343

［12］Xu Q，Shen Y，Wang H，et al.Application of response surface methodology to optimise extraction of flavonoids from fructus sophorae［J］.Food Chem，2013，138（4）：2122-2129

［13］侯學敏，李林霞，張直峰，等.響應面法優化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性［J］.食品科學，2013，34（6）：124-128

［14］黃仁術，胡曉夢，何惠利.大別山野葛根異黃酮超聲輔助提取工藝的響應面優化與還原力測定［J］.中國藥學雜志，2015，50（1）：51-57

［15］李光，余霜，陳慶富.正交設計在紅薯葉黃酮提取中的應用［J］.北方園藝，2012（1）：41-42

［16］李佩艷，王鋒，尹飛，等.響應面法優化酶法提取紅薯葉總黃酮的工藝［J］.食品工業科技，2012（1）：275-277

［17］李學坤，李莉，田盼盼，等.響應面法優化微波輔助蝸牛酶提取女貞子黃酮［J］.化學工程，2014，42（3）：6-10

［18］林建原，季麗紅.響應面優化銀杏葉中黃酮的提取工藝［J］.中國食品學報，2013（2）：83-90

［19］鄒建國，劉飛，劉燕燕，等.響應面法優化微波輔助提取枳殼中總黃酮工藝［J］.食品科學，2012，33（2）：24-28

［20］熊春華，周蘇果，沈忱，等.響應面法優化提取菊米黃酮及抗氧化活性研究［J］.中國食品學報，2014（7）：118-123

［21］趙海福，魏彥明，董曉寧，等.響應面法優化玉米須中蘆丁的提取工藝及檢測［J］.草業科學，2013，30（6）：964-972

Optimization of Water Extraction of Total Flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by Response Surface Methodology

XU Jun-fei，PENG Tai-bin，FU Qiu-xia，GUO Shu-qiong，LIU Xi-qing
（Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources，College of Biological and Food Engineering，Huaihua University，Huaihua 418008，Hunan，China）

Optimization of water extraction total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.by response surface methodology was studied.Based on the single-factor test analysis，the Plackett-Burman experimental design and steepest ascent design，while take extracted amount of total flavonoids as the response value，response surface method was applied to analyze the influence of various factors and their interaction on the extraction of total flavonoids，select an optimized progress to extract total flavonoids from Ficus Tikoua Bur..The optimal water extraction of total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.progress conditions were solid-liquid ratio 1∶50（g/mL）；soak time 50 min，extraction temperature 60℃；extraction time 50 min.Under these conditions，extracted amount of total flavonoids from Ficus Tikoua Bur.can reach 25.62 mg/g.

FicusTikouaBur.；totalflavonoids；waterextraction；responsesurfacemethodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.018

湖南省重點建設學科經費資助（2011-42）

徐君飛（1981—），女（漢），講師，博士，從事農產品加工研究。

2015-08-13