花臉香蘑菌絲體液體發酵研究

胡先運，江家志（黔南民族醫學高等專科學校，貴州都勻558000）

花臉香蘑菌絲體液體發酵研究

胡先運，江家志
（黔南民族醫學高等專科學校，貴州都勻558000）

對花臉香蘑液體發酵培養基進行優化，以菌絲體生物量為指標，采用單因素分析，優化培養基中碳源、氮源、pH值、無機鹽以及菌齡。結果表明，液體發酵培養基中，最佳碳源為土豆粉；最佳氮源為NH4Cl；最佳pH值為7；無機鹽為CuSO4和FeSO4；菌齡對菌絲體生物量沒有影響。采用正交試驗的方法，篩選出適合于花臉香蘑深層發酵培養配方為：碳源為土豆粉；氮源為NH4Cl；pH值為7；無機鹽為FeSO4；菌齡12d。

花臉香蘑；菌絲體；發酵

花臉香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］，又名紫晶口蘑、丁香蘑、花臉蘑等。其子實體細、柔軟、脆嫩、清香適口、味道鮮美，富含蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素等多種營養成分，是一種具有很高營養價值的菌［1］。德國學者Xenia Mazur［2］等用Lepista.sordida菌株發酵分離出具有抗癌、抗菌的二萜骨架化合物；肖玉珍等［3］，羅心毅等［4-5］，申慧彥等［6］先后對菌種人工馴化，子實體礦質元素，氨基酸，菌絲營養特性進行了研究。目前，液體發酵能夠快速獲得發酵產物，為獲得次生代謝產物奠定基礎。然而，花臉香蘑液體培養條件探索處于探索階段，主要是對碳源和氮源展開探索［7-9］，本文采用液體培養菌絲體的生物量為指標，篩選了適宜于花臉香蘑的液體培養基，為液體菌種大規模生產和代謝產物研究提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

花臉香蘑［Lepista sordida（Fr）Sing］：2004年12月貴州省生物研究所菌種室饋贈子實體，菌種分離，純化，編號為Lps-93001，并保存于貴州省生物研究所菌種室。

1.1.2培養基

1）菌種分離純化固體培養基（CPDA培養基）：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g、酵母膏4g、瓊脂15g、pH=6.0，配制1000mL；培養溫度：24℃。

2）液體基礎培養基：土豆200g、MgSO41.5g、KH2PO43g，配制1000 mL。

1.2方法

1.2.1菌種的分離及生長

采菇形好，生長強壯，無污染的子實體，在CPDA培養基中，進行分離，純化，24℃，恒溫培養并記錄菌絲生長情況。

1.2.2菌絲體生物量測定

發酵液經3 000 r/min離心10 min，菌絲體60℃恒溫真空干燥至恒重，即為菌絲體干重作為生物量。

1.2.3單因子試驗

用500 mL三角瓶，裝入選擇性培養基200 mL，接種塊大小約1.0 cm2，培養溫度27℃，振蕩器轉速120 r/min，培養10 d，測量菌絲干重。

1.2.4碳源對生物量的影響

以不同碳源，如：土豆粉、葡萄糖、乳糖和蔗糖各4 g，分別加入基礎培養基中，每組重復5次，培養，干燥稱重，得到不同碳源條件下的菌絲體干重。

1.2.5氮源對生物量的影響

以不同氮源，如：酵母膏、KNO3、NH4NO3、NH4Cl各0.8 g，分別加入基礎培養基中，每組重復5次，培養，干燥稱重，得到不同氮源條件下的菌絲體干重。

1.2.6不同pH值對生物量的影響

用濃度0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl，將基礎培養基pH值分別調至5、6、7、8，每組重復5次，培養，干燥稱重，得到不同pH值條件下的菌絲體干重。

1.2.7不同無機鹽對生物量的影響

將不同無機鹽，如：NiSO4、CuSO4、FeSO4各3×10-4g，分別加入基礎培養基中，每組重復5次，培養，干燥稱重，得到不同無機鹽條件下的菌絲體干重。

1.2.8不同菌齡對生物量的影響

將菌齡分別為4、8、12、16 d，分別接種到基礎培養基中，每組重復5次，培養，干燥稱重，得到不同菌齡條件下的菌絲體干重。

1.2.9正交試驗優化菌絲體液體深層發酵培養條件

500 mL三角瓶裝量為200 mL培養基，接不同時期Lps-93001菌種，接種塊大小約1.0 cm2，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl調pH值。以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，無機鹽1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌齡為因素，每個因素4個水平，使用L16（45）正交表進行試驗。共有16個組合，每個組合設5個重復。正交試驗L16（45）因素水平見表1，振蕩器轉速120 r/min，27℃培養14 d。

2　結果與討論

2.1菌種的分離及生長

花臉香蘑菌絲在CPDA培養基中的生長速率見圖1。

圖1　 花臉香蘑菌絲在CPDA培養基中的生長速率Fig.1　Mycelia growth rate of Lepista sordida in CDPA medium

由圖1可知，花臉香蘑菌絲在CPDA培養基中生長勢旺盛，粗壯，在培養過程中，菌絲初期為灰白色絨毛狀，后為淡紫色、紫色。7天后開始著淡紫色于培養基上，菌絲在前3天生長較慢，后逐漸加快，在11 d到13d時，菌絲生長速率達到最大為0.56cm/d。此后菌絲生長較慢，平均生長速度0.28 cm/d，長滿試管約17 d。

表1　正交試驗L16（45）因素水平表Table 1　The design of factors and levels on orthogonal experiment

2.2碳源對菌絲體液體發酵的影響

不同碳源對花臉香蘑液體發酵的影響見圖2。

如圖2所示，土豆粉對菌絲體發酵的生物量影響最大，達到1.402 g/200 mL，在基礎培養基中土豆粉是最容易吸收的供試碳源，且與葡萄糖、乳糖、蔗糖為供試碳源相比，達到0.1水平上的顯著差異；葡萄糖和蔗糖作為供試碳源，兩者沒有顯著差異；菌絲體發酵對乳糖的利用最差。分析結果表明，花臉香蘑菌絲體液體發酵最佳碳源為土豆粉；其次為葡萄糖和蔗糖，最差為乳糖。

2.3氮源對菌絲體液體發酵的影響

不同氮源對花臉香蘑液體發酵的影響見圖3。

如圖3所示，在基礎培養基中，供試氮源為NH4Cl

圖2　不同碳源對花臉香蘑液體發酵中生物量的影響Fig.2　The effect of carbon sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

圖3　不同氮源對花臉香蘑液體發酵中生物量的影響Fig.3　The effect of nitrogen sources on the biomass of mycelia in liquid fermentation

時，能使花臉香蘑液體發酵的生物量達到最大，達到1.181 g/200 mL，且與其他3種供試氮源酵母膏、KNO3、NH4NO3相比，達到顯著性差異，說明在花臉香蘑液體發酵中，最佳供試氮源為NH4Cl；其次為KNO3為1.012 g/200 mL，利用率最差為酵母膏和NH4NO3。

2.4pH值對菌絲體液體發酵的影響

pH值對菌絲體液體發酵的影響見圖4。

圖4　pH對花臉香蘑液體發酵中生物量的影響Fig.4　The effect of pH on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖4可知，花臉香蘑菌絲體發酵對pH值適應范圍較廣，在pH值范圍為5～8時都能生長。在酸性條件下，隨著pH值升高，花臉香蘑液體發酵生物量隨之升高，當pH值為7時，生物量達到最大，為1.202g/200mL；當pH值為8時，生物量下降。通過分析可知，當pH值為7時，花臉香蘑液體發酵生物量與pH值為5、6、8相比，達到顯著性差異。因此，在花臉香蘑液體發酵中，最佳pH值為7；其次pH值為6和8；pH值過高或過低都會使花臉香蘑菌絲體發酵生物量減小。

2.5無機鹽對菌絲體液體發酵的影響

無機鹽對菌絲體液體發酵的影響見圖5。

圖5　無機鹽對花臉香蘑液體發酵中生物量的影響Fig.5　The effect of inorganic salt on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖5可知，無機鹽為CuSO4和FeSO4時，能明顯增加花臉香蘑菌絲液體發酵生物量，且兩者之間沒有顯著性差異。當無機鹽為NiSO4時，與空白對照無顯著性差異。因此，在供試的無機鹽中，CuSO4和FeSO4能促進花臉香蘑菌絲液體發酵生物量。

2.6菌齡對菌絲體液體發酵的影響

菌齡對菌絲體液體發酵的影響見圖6。

圖6　菌齡對花臉香蘑液體發酵中生物量的影響Fig.6　The effect of fungus ages on the biomass of mycelia in liquid fermentation

由圖6可知，在花臉香蘑菌絲液體發酵中，接種菌齡為4、8、12、16 d時，對菌絲體生物量沒有影響，之間無顯著性差異。

2.7菌絲體液體深層發酵培養基優化

在液體基礎培養基中，以碳源2 g/100 mL，氮源0.4 g/100 mL，無機鹽1.5×10-4g/100 mL，pH值及菌齡為因素，每個因素4個水平，使用L16（45）正交表進行試驗。共有16個組合，每個組合設5個重復。正交試驗L16（45）因素水平見表1，結果及極差分析見表2。

表2　正交試驗結果及極差值分析Table 2　The results and range of orthogonal experiment

根據極差分析，4種因素對花臉香蘑菌絲體生物量影響依次為A＞C＞B＞D＞E，碳源和pH對菌絲體干生物量影響最大，菌齡影響最小，不同氮源和無機鹽對菌絲體干生物量也有影響。分析結果表明：實際優處理為A1B2C2D2E2；實際優處理配方為碳源為土豆粉、氮源為KNO3、pH=6、無機鹽為CuSO4、菌齡為8 d；根據極差Tij的優水平組合，提出干生物量預測優處理為A1，B4，C3，D4，E3，預測優處理配方為碳源為土豆粉、氮源為NH4Cl、pH=7、無機鹽為FeSO4、菌齡為12 d。當用預測優化處理配方進行試驗，發現所得生物量比實際優化處理更大，達到1.8027 g/200 mL，因此，由實際優處理和預測優處理得出，液體發酵培養基最佳碳源：土豆粉；氮源：NH4Cl；pH7；無機鹽為FeSO4；菌齡12 d。

3　結論

花臉香蘑菌絲在CPDA培養基中生長勢旺盛，粗壯。菌絲在前3天生長較慢，后逐漸加快，進入指數生長期，在11 d到13 d時，菌絲生長速率達到最大。

探討了花臉香蘑菌絲體發酵生物量的主要因素有：碳源、氮源、pH值、無機鹽以及菌齡，并且確定了單因素試驗的最佳水平，通過單因素試驗發現，花臉香蘑菌絲體液體發酵最佳碳源為土豆粉；最佳氮源為NH4Cl；最佳pH值為7；無機鹽為CuSO4和FeSO4；菌齡菌絲體生物量沒有影響。

通過正交試驗表明，優化液體發酵培養基為：碳源為土豆粉、葡萄糖；氮源為NH4Cl；pH值為7；無機鹽為FeSO4；菌齡為12 d。

［1］卯曉嵐.中國大型真菌［M］.鄭州：河南科技出版社，2000：177-180

［2］Mazur X，backer U，Anke T，et al.Two new bioactive diterpenes from Lepista sordida［J］.Phytochemistry，1996，43（2）：405-407

［3］肖玉珍，趙靜珍.花臉蘑（Lepista Sordida）人工馴化栽培技術的研究［J］.東北農業大學學報，1995，26（1）：7-12

［4］羅心毅，洪江，張勇民.花臉香蘑元素測定［J］.中國食用菌，2003，22 （4）：43-44

［5］羅心毅，洪江，張勇民.人工栽培花臉香蘑氨基酸研究［J］.氨基酸與生物資源，2003，25（3）：14-15

［6］申慧彥，劉朝貴.花臉蘑菌絲營養特性的研究［J］.食用菌，2003（3）：5-6

［7］孟玲，王麗華，王蘭英，等.花臉香蘑菌絲體發酵條件的研究［J］.食品研究與開發，2011，32（6）：121-125

［8］胡先運.花臉香蘑田間栽培、營養評價及液體發酵特性研究［D］.貴陽：貴州師范大學，2007：40-50

［9］羅倩，王瑩，張林.貴州花臉香蘑HL-07液體發酵條件優化研究［J］.種子，2015，34（5）：88-91

Study on Liquid Fermentation of Lepista sordida Mycelia

HU Xian-yun，JIANG Jia-zhi （Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，Guizhou，China）

The liquid fermentation medium of Lepista sordida was optimized.We optimized carbon sources，nitrogen sources，pH，inorganic salt，fungus ages in medium with the biomass of mycelia as determining parameter by single factor analysis.The results showed that the best carbon source was to be the potato flour，the best nitrogen source was to be NH4Cl，the best pH was to be 7，the best inorganic salt was to be CuSO4and FeSO4in liquid fermentation medium.Meanwhile，the optimized of medium for liquid fermentation of Lepista sordida was screened through orthogonal experiment methods.The optimized formula of liquid fermentation medium were contained that carbon source was potato flour，nitrogen source was NH4Cl，pH=7，and inorganic salt was FeSO4，fungus ages was at 12 d.

Lepista sordida；mycelia；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.044

國家自然科學基金項目（21545006）；貴州省自然科學基金項目（2015GZ48861）；貴州省教育廳科研基金項目（黔教科20090114）；黔南醫專科研基金重點項目（QNYZ200905，QNYZ201601）

胡先運（1981—），男（漢），副教授，在讀博士，研究方向：生物化學教學及研究。

2015-08-06