酶解制備鹿血漿活性多肽工藝研究

秦鳳賢 賈冬舒 武軍 胡鐵軍 陳巍 莊紅

鹿血漿是鹿血經抗凝處理后，利用離心分離技術得到的液體，占全血總量的55%左右。鹿血漿中水分占90%～92%，蛋白質占 6.5%～8.5%，還有約2%的小分子物質。鹿血漿中主要的生物活性物質是鹿血漿蛋白，其主要是由球蛋白、白蛋白、纖維蛋白原組成。本研究以梅花鹿血液為原料，通過高速離心作用分離出鹿血漿，再利用蛋白酶的催化作用將其水解制備成鹿血漿肽。試驗中以水解度為篩選指標，考察了蛋白酶種類、復合酶配比、溫度、加酶量、pH、時間、熱處理溫度、熱處理時間對水解度的影響，并運用響應面試驗優化方法對試驗結果進一步優化，得出最優的酶解工藝參數，且對最優酶解參數下制備的鹿血漿肽的抗氧化能力與酶解前的鹿血漿作了對比。

材料與方法

材料與試劑。鹿血：長春嘉禾鹿業有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶為諾維信天津公司生產；DPPH、ABTS為Sigma公司；檬酸鈉，甲基紅、溴甲酚綠指示劑，碳酸氫鈉 ，氫氧化鈉，鹽酸，硼酸，無水乙醇，硫酸銅，硫酸鉀，濃硫酸，鐵氰化鉀，三氯乙酸、甲醛等均為北京化工廠。以上試劑均為分析純。

儀器與設備。電子分析天平、PH計、全自動凱氏定氮儀、高速冷凍離心機、紫外可見分光光度計、磁力攪拌器。

方法。（1）鹿血漿的酶解。取10ml新鮮抗凝鹿血，根據鹿血漿中的蛋白質含量用蒸餾水調節底物濃度，用2mol/l的HCl或NaOH調節，加入一定量的酶，在恒溫水浴振蕩器中水解一定時間，取出后沸水浴90℃，5min滅菌，冷卻至室溫，調pH 值至7，4000r/min離心10min，取上清液備用。（2）鹿血漿中蛋白質的測定，參照 GB5009.5-2010方法進行測定。（3）蛋白質水解度的測定。蛋白質水解度DH=樣品中總氮/酶解液中游離氨基氮×100%；游離氨基氮的測定采用甲醛滴定法。（4）抗氧化活性測定方法。（5）DPPH自由基清除率的測定。取 25μl樣品溶液與0.7ml、0.1 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液混勻，避光放置20min，在波長517 nm 下測其吸光值 Ai；同時測其樣品對照Aj和空白對照Ac。

DPPH 清除率=

（6）ABTS 自由基清除率的測定。將 7 mmol/L ABTS 溶液與 2.45 mmol K2S2O8溶液按 1：1 混合均勻，避光放置 12-16 h，用磷酸鹽緩沖溶液（0.2 M，pH7.4）進行稀釋，于 734 nm 波長下吸光度達到 0.70±0.02，為 ABTS 測定液。取 4.0 ml ABTS 測定液，加入 100 μl樣品溶液，振蕩 30 s，在波長為 734 nm 下測定吸光值（A1），空白管（A0）用磷酸鹽緩沖溶液替代樣品，對照管（A2）用磷酸鹽緩沖溶液代替 ABTS 測定液。

ABTS 自由基清除率=

（7）還原力的測定。在0.5 ml的樣品溶液中添加2.5 ml pH 值為 6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 ml 1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻后，50℃水浴，保溫 20 min，再加入 2.5 ml 10%的三氯乙酸，4000 r/min 離心 10 min，取上清 2.5 ml 與 0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，靜置10 min ，在波長 700 nm 下測定吸光值，吸光度值越大，樣品還原能力越強。

結果與分析

酶解工藝參數的響應面優化。（1）響應面試驗結。在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、加酶量、pH 值為自變量，以水解度為響應值，采用響應面試驗設計方法進行三因素三水平優化試驗，試驗結果如表1 所示。

（2）回歸方程的建立和模型評價。利用 RAS軟件對影響鹿血漿蛋白酶解的工藝參數進行優化，所得的二次回歸方程如下：

式中： X1-溫度（℃）；X2-加酶量（%）；X3-pH（%）。

并對回歸模型進行方差分析，結果表明模型的P=0.0004<0.01，說明回歸方程描述的各自變量與響應值之間關系顯著，模型擬合性好。

鹿血漿酶解前后抗氧化能力比較。將在最優酶解工藝條件下制備的鹿血漿酶解液與未水解的鹿血漿進行DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及還原能力比較，結果如表2 所示。

由上表可知，鹿血漿蛋白經酶解處理成鹿血漿肽之后，其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原能力均有明顯提高，說明鹿血漿經酶解反應后，保留并加強了其抗氧化功能。

結論

通過實驗確定以中性蛋白酶和風味酶以1：1組成復合酶，酶解梅花鹿血漿原料，其最佳酶解工藝條件為加酶量為5.8%，酶解的溫度為45.2℃，pH為7.05，所得酶解液的水解度為18.60%；酶解液的氧化還原性及自由基的清除能力，明顯優于酶解前。

基金項目：長春市重大科技攻關計劃（鹿血活性多肽微膠囊制備及產業化關鍵技術，項目編號：14KG070）。

作者簡介：秦鳳賢（1980-），女，工程師。研究方向為食品科學肉產品；通訊作者簡介：武軍（1964—），女，副教授，研究方向為食品科學。

（作者單位：秦鳳賢 賈冬舒 武 軍 胡鐵軍 陳 巍 長春科技學院生物食品學院；莊 紅 吉林大學軍需科技學院）