復合菌系的構建及其對玉米秸稈預處理的研究

魏如騰,侯紅萍,白春艷

(山西農業大學 食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

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復合菌系的構建及其對玉米秸稈預處理的研究

魏如騰,侯紅萍*,白春艷

(山西農業大學 食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

黑曲霉,芽孢桿菌,里氏木霉,解脂假絲酵母,復合菌系,玉米秸稈

纖維素是地球上最豐富的多糖化合物,廣泛存在于植物中,有資料表明,全世界每年生產纖維素及半纖維素的總量為850億t。其中大部分農作物秸稈還是以焚燒的形式被處理掉,這不僅造成大量資源的浪費,還造成環境污染。近年來,隨著人口增長、糧食短缺、石油危機等的出現,將纖維素水解為小分子單糖,單糖再通過微生物發酵生產各種有用的產品顯得尤為重要。

秸稈預處理方法很多,其中物理、化學和生物預處理應用較廣泛,原理都是借助外力改善秸稈的質地和結構。物理和化學預處理已有很多研究,但這兩種方法會增加費用且易造成二次污染。生物預處理是在人工控制下,利用一些微生物的分解作用破壞秸稈的大分子物質,具有高效清潔的優點[1]。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑曲霉種子培養基、里氏木霉種子培養基、芽孢桿菌種子培養基、液體發酵產酶培養基配制方法參考文獻[3]。

PHS-25C型數字酸度計上海人普儀器有限公司;TGL-16G高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司;722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;HP-500型電熱恒溫培養箱北京光明醫療儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1纖維素酶活力的測定以水解濾紙的酶活力代表纖維素酶的總活力(FPA酶活),以水解羧甲基纖維素的活力代表葡聚糖內切酶的活力(CMC酶活)[4]。

1.2.2葡萄糖標準曲線的制作用無水葡萄糖(分析純,105 ℃下烘干至恒重)配制成1 mg/mL的葡萄糖標準溶液,分別取此標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于比色管中,補水至2.0 mL,加入2.0 mL DNS試劑,蓋上蓋,沸水浴5 min,立即冷卻,終止反應,定容至25 mL,搖勻后,在550 nm處測定吸光值(OD值),每管重復測3次,結果取平均值。以吸光值為縱坐標,葡萄糖毫克數為橫坐標繪制曲線圖并建立回歸方程,見圖1所示。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Standard curve of glucose

1.2.3葡聚糖內切(CMC)酶活力的測定方法取25 mL比色管,加入適當稀釋的上清酶液0.5 mL和1.0 mL濃度為1%的CMC-Na溶液,再加1.0 mL用pH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制成1%(w/v)的羧甲基纖維素懸浮液,蓋上蓋子。在50 ℃、振幅80的條件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流動水冷卻并定容至25 mL,混勻,在550 nm處測OD值。

1.2.4濾紙(FPA)酶活力的測定方法取25 mL比色管,以1 cm×6 cm(50±1) mg的新華濾紙條為底物,加入適當稀釋的上清酶液0.5 mL和pH4.8的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,蓋上蓋子。在50 ℃、振幅80的條件下水浴30 min。取出后迅速加入2.0 mL DNS溶液,之后沸水浴5 min,水浴后立刻取出用流動水冷卻并定容至25 mL,混勻,在550 nm處測OD值。

1.2.5酶活定義在一定的溫度及pH條件下,1 min從底物溶液中分解產生1 μg還原糖所需要的酶量即為一個酶活單位,簡稱為U[5]。

1.3各菌株的產纖維素酶情況

1.3.1芽孢桿菌T7.0產酶情況將芽孢桿菌T7.0按6%接種量接種于裝有50 mL產酶培養基的250 mL三角瓶中,33 ℃、140 r/min發酵5 d,分別測定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.3.3里氏木霉產纖維素酶情況將里氏木霉按10%接種量接種于裝有50 mL產酶培養基的250 mL三角瓶中,30 ℃、140 r/min發酵5 d,分別測定其CMC酶活和FPA酶活[2]。

1.4三株菌復合發酵產纖維素酶情況

1.5復合菌不同接種方式對酶活的影響

不同酶組分分泌的纖維素酶類型不同,酶活也不盡相同,故復合菌系可提高降解纖維素效率[7]。在接種總量一定的條件下,通過改變復合菌的接種方式,改變不同酶組分的產量,從整體上提高纖維素的降解能力。另外,某一菌種所分泌的代謝產物也有可能成為其它菌種生長所需的營養成分,從而加快菌種生長并分泌纖維素酶[7]。

1.6復合菌對不同秸稈降解效果的研究

將復合菌按9%接種量(芽孢桿菌T7.0∶黑曲霉Z34∶里氏木霉=2∶1∶2)接入裝有100 mL混合產酶培養基的250 mL三角瓶中,分別以玉米秸稈、小麥秸稈、黃豆秸稈(均過40目),于31 ℃、140 r/min條件下發酵5 d,測其CMC酶活力。

表2　復合菌之間的接種比例Table 2　The proportion of Inoculation among the compound bacteria

1.7解脂假絲酵母對玉米秸稈進行生物預處理效果的研究

1.7.1玉米秸稈預處理時間對降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養液按2%接種量接入玉米秸稈產酶培養基,分別處理0、12、24、36、48、60 h以后接入復合菌,于31 ℃、140 r/min下發酵5 d,測其CMC酶活。

表1　復合菌的接種順序Table 1　Inoculation sequence of compound bacteria

1.7.2解脂假絲酵母接種量對降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養液分別按1%、2%、3%、4%、5%接種量接入玉米秸稈產酶培養基,處理36 h后接入復合菌,于31 ℃、140 r/min下發酵5 d,測其CMC酶活。

1.7.3玉米秸稈粉碎度對降解效果的影響將解脂假絲酵母的種子培養液按2%接種量接入不同粉碎度的玉米秸稈(10、20、30、40、50、60、70目)產酶培養基中,處理36 h后接入復合菌,于31 ℃、140 r/min下發酵5 d,測其CMC酶活。

1.8正交實驗

在單因素實驗的基礎上,采用Minitab16軟件設計正交試驗，根據三因素三水平試驗對解脂假絲酵母和復合菌共同發酵產纖維素酶進行優化。因素水平表見3。

表3　正交實驗因素水平Table 3　Factors and levels of the orthogonal test

2　結果與分析

2.1各菌株的產纖維素酶情況

2.1.1芽孢桿菌T7.0產酶情況從圖2可以看出芽孢桿菌T7.0在第1 d時,FPA酶活比CMC酶活高,第2 d CMC酶活力和FPA酶活力開始升高,當第3 d時CMC和FPA酶活力活力均達到最高,分別為128.06、121.75 U/mL,從第4 d開始兩種酶活開始下降,可能是營養物質消耗,代謝產物積累,導致活力下降。

圖2　芽孢桿菌T7.0產纖維素酶的情況Fig.2　The enzyme production of Bacillus T7.0

圖3　黑曲霉產纖維素酶的情況Fig.3　The enzyme production of aspergillus niger

2.1.3里氏木霉產纖維素酶情況從圖4可以看出第1 d菌體生長旺盛,在第2 d時活力達到最高,CMC酶活力和FPA酶活力分別為157.61、174.86 U/mL,從第3 d開始,由于營養物質缺乏、菌體老化、產物抑制等原因造成酶活力下降。

由上述結果可知,若將不同菌種進行混合培養,優勢互補,有利于完善纖維素酶組分、提高酶活、縮短產酶周期、提高纖維素降解效率[8]。

表4　復合菌的接種順序對CMC酶活的影響Table 4　Effects of inoculation sequence of compound bacteria on CMC enzyme activity

表5　復合菌的接種比例對酶活的影響Table 5　Effects of the proportion of the compound bacteria on the activity of the enzyme

圖4　里氏木霉產纖維素酶情況Fig.4　The enzyme production of Trichoderma reesei

2.2三株菌復合發酵產纖維素酶情況

圖5　復合菌產酶活力測定Fig.5　Determination of the activity of the compound bacteria producing enzyme

2.3復合菌不同接種方式對酶活的影響

2.3.2復合菌的接種比例對酶活的影響由表5可知,接種比例不一樣,其CMC酶活存在差異,實驗7(黑曲霉Z34∶里氏木霉∶芽孢桿菌T7.0=2∶1∶2)的酶活最高,達到365.98 U/mL,比實驗1高出12.99%。

2.4復合菌對不同秸稈降解效果的研究

從圖6可以看出復合菌對玉米秸稈的降解效果明顯高于小麥秸稈與黃豆秸稈,達到388.18 U/mL。后續實驗進一步研究了復合菌對玉米秸稈的降解效果。

圖6　復合菌對不同秸稈降解效果的影響Fig.6　Effect of compound bacteria on the degradation of different straw

2.5解脂假絲酵母對玉米秸稈進行生物預處理效果的研究

2.5.1玉米秸稈預處理時間對降解效果的影響由圖7可知,隨著處理時間的延長,CMC酶活力逐漸增大,當達到36 h時活力達到最高點,并且酶活力基本趨于穩定。

圖7　玉米秸稈預處理時間對降解效果的影響Fig.7　Effect of pretreatment time on degradation of corn stalk

2.5.2解脂假絲酵母接種量對降解效果的影響從圖8可知,當解脂假絲酵母接種量為2%時,CMC酶活力最高,接種量小,在規定的培養時間內,有限的解脂假絲酵母種子液不足以萌發足夠的菌體,菌體生長緩慢,產酶活力低;而接種量大,導致菌體過多,培養基中的營養物質主要用于菌體自身的生長繁殖,產酶活力也較低。

表7　正交實驗方差分析Table 7　Variance analysis of the orthogonal test

圖8　解脂假絲酵母接種量對降解效率的影響Fig.8　Effect of inoculation amount on degradation efficiency of Candida lipolytica

2.5.3玉米秸稈粉碎度對降解效果的影響從圖9可以看出,隨著秸稈粉碎度的越來越大,CMC酶活力也逐漸變大。當秸稈粉碎度為30目時,相比10目時提高了8.04%,粉碎度為40目時,相比10目時提高了8.96%,而秸稈粉碎度40目相比30目只提高了0.85%,考慮到生產應用,減少成本以及機械損耗[9],選擇玉米秸稈粉碎度為30目。

圖9　玉米秸稈粉碎度對降解效果的影響Fig.9　Effects of corn stalk crushing degree on the degradation effect

2.6正交實驗結果與分析

從表6可以看出各因素對CMC酶活的影響大小依次為接種量>時間>粉碎度。最佳組合是A2B2C3,即:時間36 h、接種量2%、粉碎度40目。

根據表6可以確定,理論上的最優組合是A2B2C3,這個組合與5號實驗得到的最優組合A2B2C3相同,因此,可以確定最優組合是A2B2C3,即時間36 h、接種量2%、粉碎度40目,此時酶活力為408.55 U/mL,但是考慮到大規模生產的生產成本以及機械損耗,組合A2B2C2(酶活力為404.28U/mL),即時間36 h、接種量2%、粉碎度30目,帶來的效益要比組合A2B2C3大,所以選擇組合A2B2C2,即時間36h、接種量2%、粉碎度30目。

從表7可知,各因素對酶活的影響大小依次是:接種量、時間、粉碎度,其中時間、接種量對酶活影響極顯著,粉碎度影響不顯著。

3　結論

表6　正交實驗結果與分析Table 6　Results and analysis of orthogonal test

[1]趙方圓,范寧杰,朱建春,等.纖維素高效降解菌YN1的篩選及其降解特性[J]. 微生物學通報. 2010(04):496-502

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[3]張英,侯紅萍. 酵母菌、霉菌與細菌混合發酵產纖維素酶的研究[D].太谷:山西農業大學,2011.

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[5]汪金萍.單菌株發酵和混合菌株發酵產纖維素酶的研究[D].南昌:南昌大學,2007.

[6]楊盛,侯紅萍.高效降解纖維素混合茵的篩選及其產酶條件的研究[J].中國釀造.2008,21:20-23.

[7]李國強,韓松.兩種木霉復合菌產酶的條件優化及其對谷子秸稈降解的研究[J].生物工程學報,2011,21:20-23.

[8]高星星.里氏木霉與黑曲霉混合發酵產纖維素酶的而研究[D].合肥:合肥工業大學,2012.

[9]易錦瓊,賀應龍,蘇小軍,等.玉米秸稈酶解工藝條件優化[J].中國釀造，2011(3):24-26.

Construction of composite microbial systems and its effect on corn stalk pretreatment

WEI Ru-teng,HOU Hong-ping*,BAI Chun-yan

(Food Science and Engineering College,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

Aspergillusniger;Bacillus;Trichodermareesei;Candidalipolytica;composite microbial systems;corn stalk

2015-09-02

魏如騰(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：食品微生物與發酵技術,E-mail:weiruteng565@163.com。

侯紅萍(1965-)，女，碩士，教授，研究方向：食品與發酵工程技術：E-mail:sphhping@126.com。

山西省科技攻關項目(201403110192)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0177-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.026