代謝組學在發酵食品有毒代謝產物分析中的研究進展

繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎,勵建榮

(渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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代謝組學在發酵食品有毒代謝產物分析中的研究進展

繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎*,勵建榮

(渤海大學食品科學與工程學院,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

食品發酵過程中可形成一些有毒代謝產物,對發酵食品產生了一定的安全隱患。代謝組學作為一門新興技術,可對生物代謝過程中產生的小分子代謝產物實現實時分析與監測。應用氣相色譜-質譜聯用、離子色譜、反相高效液相色譜、高效液相色譜結合串聯質譜、液相色譜-電噴霧電離飛行時間質譜等代謝組學技術分析酒飲料、葡萄酒、奶酪、香腸、醬油等食品中的有毒代謝產物,可實時監測食品發酵過程中的氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽的形成與變化狀況,為提高發酵食品的安全控制水平和推動代謝組學在發酵食品領域的應用提供借鑒與參考。

代謝組學,發酵食品,有毒代謝物,分析

代謝組學(Metabolomics)在“組學”領域是一門新興學科,仿效基因組學、轉錄組學和蛋白組學的研究思想,對機體、組織、細胞等代謝過程形成的分子量低于1500 ku或1000 ku的小分子代謝產物進行同步檢測和定性分析[1-2]。代謝產物包括內源性和外源性小分子物質,主要有肽類、氨基酸、核酸、簡單糖類、有機酸、維生素、多酚和生物堿等,這些產物更加直接地展現機體的代謝過程[3]。

代謝組學研究流程包括樣品制備、數據采集和數據分析及解釋,通過現代各種高新技術對代謝物進行分離、檢測和定性定量分析,將收集的信息整合在一起。代謝輪廓分析(靶向代謝組學)和代謝指紋分析(非靶向代謝組學)是應用于代謝組學的兩種互補分析方法,前者通常驗證事先提出的假設,研究與特定代謝途徑相關的代謝物的變化,后者對樣品進行整體性定性分析,根據圖譜差異對代謝產物進行快速鑒別和分類[4-6]。

代謝組學已廣泛應用于微生物學[7]、植物生理學[8]、醫學[9]、藥物學[10]、動物學[11]等研究領域。在發酵食品領域,代謝組學主要對發酵過程的物質變化進行監控和對風味物質進行分析等。Kang等應用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜(ultra performance liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometer,UPLC-TOFMS)技術,對韓國豆醬發酵過程進行監控,通過偏最小二乘法-判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)獲得了豆醬發酵過程中與產品成熟相關的22種標志性代謝產物[12]。Lee等[13]通過核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術研究不同國家綠茶發酵過程中的風味物質變化情況,發現風味物質形成與環境因素息息相關,為發酵茶的生產提供重要的參考信息。

傳統發酵食品因特定微生物發酵而具有獨特的風味、口感和較高的營養價值,深受各國人們的青睞。由于發酵基質成分復雜,參與的微生物類群和代謝途徑多樣,發酵食品中富含各種各樣的代謝產物,這些產物中也可能是對人類有毒有害的代謝物質。隨著發酵食品產業的快速發展,發酵食品安全問題的研究越來越受到人們的重視。目前,對發酵食品中有毒代謝產物只停留在對產品檢驗的階段,尚不能實現對發酵過程的實時監控。代謝組學的引入必將對發酵食品的安全控制產生深遠的影響。

本文從代謝組學的角度出發,對傳統發酵食品中有毒代謝產物如氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽的分析檢測應用研究進行綜述,為保障發酵食品安全提供借鑒與參考。

1　代謝組學研究方法及其在發酵食品中的應用1.1　樣品的采集和制備

樣品的采集與制備是代謝組學研究的基礎,需經過嚴格的實驗設計,以達到代謝組學所要求的分析精度。樣本采集要有足夠的數量且需具有代表性,有效減少樣品個體差異對結果的影響[14]。根據研究對象、目的和分析技術不同,樣品的制備過程明顯不同。對于非靶向代謝組學分析,需最大程度地獲取代謝產物的數量,要求樣品預處理方法具有普適性與無偏性。而對于靶向代謝組學分析,對代謝物提取效率和選擇性的要求會進一步提高[15]。

傳統發酵食品中各種微生物共棲生長,賦予食品復雜而完整的酶系,為避免酶活性殘留或氧化還原過程降解代謝產物或產生新的代謝產物,因此,樣品制備后通常對不同發酵時期的樣品進行淬滅處理,采用-80 ℃低溫、液氮等方式保存備用[16]。針對提取效率低的問題,一般選擇不同比例的水和有機溶劑(如甲醇、己烷等)進行提取。Lee等采用異丙醇、乙腈和水(3∶2∶2)的混合物對冷凍干燥的發酵豆瓣醬樣品進行提取,分析發酵過程中的初級代謝產物變化,取得了較好的效果[17]。

1.2檢測技術

經采集和制備的樣品,通過合適的方法分析其中的代謝產物。因代謝產物組成復雜、含量差異和樣品制備過程的偏差等問題,目前尚無一種能夠提取和檢測所有代謝產物的分析方法。核磁共振(NMR)和質譜(mass spectrometry,MS)是代謝組學廣泛應用的主要分析技術之一[18]。

1.2.1核磁共振(NMR)NMR是代謝組學研究的主要分析技術,其優勢在于樣品不需要繁瑣的前處理,能夠對樣品實現非破壞性、無偏向的檢測,具有良好的重現性和客觀性,還具有高通量和較低成本的優勢[19-20]。核磁共振譜包括氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、氮譜(15N-NMR)和磷譜(31P-NMR),其中以1H-NMR 應用最為廣泛。Papotti等以1H-NMR技術為基礎,結合多變量分析,在意大利香醋和傳統香醋的特征描述和質量控制的研究中取得良好的效果[21]。Jeong等研究韓國泡菜在自然發酵過程中的細菌菌相和代謝產物之間的關系,利用1H-NMR技術分析表明游離糖、丙三醇和乙醇可作為發酵時間和質量控制的指示物[22]。

1.2.2質譜分析法(MS)與NMR技術相比,MS具有較高的靈敏度和特異性,可實現對代謝物的定性和定量分析[23]。通常MS和氣相色譜(gas chromatogram,GC)或液相色譜(liquid chromatogram,LC)技術聯用分析各種小分子代謝產物[24]。針對非靶向代謝組學分析,樣品先通過GC和LC處理后,再進入MS進行分析[25]。氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)因具有較高的分離能力和良好的穩定性應用于代謝組學研究,一般用于分析氨基酸、游離脂肪酸和有機酸等初級代謝產物[26]。液相色譜-質譜聯用(LC-MS)適合分析大量的次級代謝產物,包括生物堿、黃酮類、皂苷類、酚酸類和多胺類等[27]。Park等[28]應用GC-MS技術對傳統發酵豆制品的不同發酵階段進行靶向代謝組學分析,結果表明大多數氨基酸在早期發酵時期含量較低,到發酵后期有所升高,脂肪酸含量在整個發酵過程中保持升高的趨勢,除了酒石酸外,其他有機酸含量一直呈現降低趨勢。Fraser等[29]首次采用LC-MS和GC-MS聯合技術對奶酪發酵過程中的水溶性和揮發性代謝產物進行非靶向代謝指紋分析,共鑒定出包括研究較少的維生素、尿酸、肌酸、L-肉堿等45種小分子代謝物。

1.2.3數據分析代謝組學的數據分析包括原始數據預處理和統計分析方法。原始數據預處理需要對原始數據進行濾噪、歸一化、標度化、色譜峰對齊和數據轉換等步驟,保留與組分相關的信息,消除多余干擾因素的影響,使其能夠進行后期的數據分析[30]。多元統計方法是代謝組學數據分析的重要手段,主要分為非監督和監督方法,非監督方法包括主成分分析(principal component analysis,PCA)、自組織圖(self-organizing map,SOM)和聚類分析(cluster analysis,CA)等。監督法包括最小二乘法(partial least squares,PLS)、顯著性分析(discriminant analysis,DA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)等[31]。Piras等[32]采用主成分分析法(PCA)處理NMR分析意大利奶酪代謝組學的研究數據,由成熟時間和發酵劑的類型對奶酪進行分類。

表1　代謝組學在發酵食品有毒代謝物分析中的應用Table 1　Application of metabolomics on analysis of toxic metabolite in fermented food

注:NA表示文獻中未報道。

2　代謝組學在傳統發酵食品有毒代謝產物的分析

總體看來,大多數以傳統的天然發酵工藝為主,發酵食品工業化程度不高,發酵工藝中微生物菌群復雜且發酵過程難以控制,導致發酵食品存在一定的安全性問題。如酒飲料發酵過程可能是形成氨基甲酸乙酯的主要來源,其次是谷物類和豆類發酵食品。發酵蔬菜在腌漬過程中易在微生物的作用下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。發酵肉制品易受微生物的污染形成生物胺[33]。

國內外有關代謝組學在發酵食品安全中的應用研究尚不多見。表1是近些年代謝組學在發酵食品中有毒代謝產物分析的研究概況,主要針對發酵食品中氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽分析檢測中樣品前處理、研究方法、數據處理等。

2.1氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate,EC)

EC屬于多位點致癌物,具有一定的神經毒性、強烈的肺毒性和較強的致癌性,國際癌癥研究機構正式將EC劃列為2A類致癌物(人類可能致癌物)[34]。在食品發酵過程中EC可由尿素、氰化物、瓜氨酸、氨甲酰磷酸鹽等前體物質與乙醇反應形成,主要存在于酸奶、奶酪、醬油及酒飲料等發酵食品中[35]。Wu等利用GC-MS技術對中國發酵食品和酒飲料中的EC含量進行檢測,發現酒飲料中EC含量在2.0～515.0 μg/kg范圍內,發酵紅腐乳中EC含量最高,達到182 μg/kg[36]。2002年,聯合國糧農組織制定了EC的國際標準,規定食品中EC含量不得超過20 μg/L[37]。因此,檢測發酵食品中EC對食品安全以及人體健康具有重要意義。

EC在發酵食品中屬痕量物質,需要靈敏度較高的檢測儀器才能檢測,應用較多的是GC-MS。Park等采用高效液相色譜結合串聯質譜(HPLC-MS/MS)測定韓國釀造醬油中的EC,在0.1～20.0 μg/L濃度范圍內具有良好的線性關系。與GC-MS方法對比,HPLC-MS/MS 法具有更低的檢測限和更好的重復性[38]。Wu等利用GC-MS技術分析了浙江黃酒在發酵和貯藏過程中EC含量的變化,結果發現發酵過程中EC含量增加緩慢,經過煎酒后EC含量迅速增加,冷卻至室溫過程中快速冷卻比自然冷卻的EC含量要少,高溫和長期儲存能夠使EC含量增加。通過對煎酒條件如溫度、時間、冷卻過程等進行優化,可能減低其EC含量[39]。

發酵食品營養豐富,基質復雜多樣,很容易對檢測結果造成干擾。因此,在采用儀器分析方法檢測EC的含量之前,通常需要對發酵食品進行預處理。Lim等[40]優化樣品前處理條件,應用GC-MS代謝組學方法分析泡菜、發酵豆瓣醬、發酵魚制品、酸奶、面包、醋和奶酪中的EC含量,優化后最低檢測濃度為10 ng/mL,回收率為76.9%～118.1%。Le?a J M等通過不同吸附材料的微萃取技術提取葡萄酒中的EC,結合GC-MS檢測發現C8和二氯甲烷是提取葡萄酒中EC的最佳吸附劑和溶劑[41]。

2.2生物胺(Biogenic Amine,BA)

BA是一類堿性含氮化合物,主要來源于發酵過程中微生物的降解作用。微生物產生的蛋白酶可將原料中蛋白質分解形成氨基酸,進一步脫羧后形成BA,其中乳酸菌的作用最為突出[42]。發酵食品中的BA與原料質量、發酵過程控制以及釀造貯藏過程中受微生物污染的程度密切相關。BA的形成需要三個條件:(1)發酵基質中游離氨基酸或蛋白質的含量;(2)產生氨基酸脫羧酶的微生物;(3)發酵基質促進微生物生長的條件[43]。BA雖是動植物和多數微生物體內的正常代謝成分,若含量過高會產生毒性作用,危害生物體正常代謝[44]。

發酵食品中的BA包括芳香胺(酪胺、苯乙胺、多巴胺等)、脂肪胺(腐胺、精胺、亞精胺等)和雜環胺(組胺、色胺等)[45]。Gianotti等利用HPLC-MS/MS技術對奶酪中的BA進行測定,結果顯示在中期成熟階段酪胺和色胺濃度相對較高。由于成熟和貯藏過程防止了微生物的污染,腐胺、亞精胺、精胺濃度相對較低[46]。De等為評估干發酵香腸的安全性,對101種樣品進行檢測,利用基于反相高效液相色譜(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)檢測干發酵香腸中的BA。通過主成分分析和聚類分析,僅在一種產品中發現腐胺和尸胺的含量達到了中毒的水平[47]。Arbulu等探討了釀造葡萄酒中代謝物的種類,以液相色譜-電噴霧電離飛行時間質譜技術(LC-ESI-TOFMS)為基礎,利用非靶向代謝組學對葡萄酒中的非揮發性代謝產物進行鑒定,通過主成分分析共鑒定出411種不同的代謝產物,其中BA質量分數為4.0%[48]。

BA含量也可作為評價葡萄酒品質的指標之一,組胺、酪胺、尸胺是葡萄酒中最具代表性的胺類。Martuscelli等利用HPLC方法對葡萄酒中的BA進行監測,確立了影響三種葡萄酒品質的標記物對葡萄酒的品質進行風險評估,為葡萄酒釀造過程安全控制奠定了基礎[49]。

2.3硝酸鹽和亞硝酸鹽

傳統發酵食品中亞硝酸鹽來源于原料中的硝酸鹽,特別是蔬菜中硝酸鹽含量較高,平均含量達1500 mg/kg。在發酵過程中,分泌硝酸鹽還原酶的微生物可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽可與仲胺類物質生成強致癌的亞硝胺[50]。我國國標GB 2762-2012規定蔬菜及其制品、腌漬蔬菜中由環境污染帶入的、非有意加入的亞硝酸鹽允許的限量不得超過20 mg/kg[51]。

Iammarino等[52]采用離子色譜法(ion chromatography,IC)對180種奶酪中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量進行檢測,所有樣品中均未檢測出亞硝酸鹽,但在21種樣品中檢測出硝酸鹽,其中未成熟干酪中硝酸鹽含量最高,達到58.6 mg/kg。劉廣福等[53]采用離子色譜法(IC)對酸菜發酵過程中不同時間采集的樣品進行分析,比較接種發酵和自然發酵酸菜的亞硝酸鹽含量,發現自然發酵法生產的酸菜發酵初期亞硝酸鹽含量較高,峰值出現在第7 d,含量為20.84 mg/kg,并提出應將生產周期控制在30 d以上。Akyüz等[54]分別用GC-MS和液相色譜-熒光檢測器(liquid chromatography-fluorescence detector,LC-FLD)技術檢測土耳其奶酪和發酵香腸中的硝酸鹽和亞硝酸鹽,發酵香腸中硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度分別達到647.0 mg/kg和17.8 mg/kg。

3　結論與展望

本文主要介紹了應用代謝組學研究方法對一些發酵食品中的氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽等有毒代謝物研究的最新進展。通過優化發酵和釀造條件,可實現對發酵食品中氨基甲酸乙酯、生物胺和亞硝酸鹽等有害物質的在線監測,達到消除和控制有毒代謝物的目的。因此,可以看出代謝組學在食品發酵領域取得的研究優勢。

代謝組學作為一門新興學科和實時監控的技術手段,雖然在生物學及其相關領域得到廣泛應用,但針對發酵食品中有毒代謝物研究處于起步階段。由于發酵食品中代謝產物的來源和形成的復雜性,因此,代謝組學在食品科學領域的發展趨勢一方面迫切需要代謝組學分析技術具有更高的靈敏度、精確度和時效性,另一方面是將代謝組學與基因組學、轉錄組學和蛋白質組學相結合,探究微生物與食品品質和安全的內在聯系。隨著前處理手段的不斷完善,分離和檢測技術水平的不斷提高,將為促進傳統食品發酵工業的全面技術改造,提高食品安全性起到較大的推動作用。代謝組學必將對提高食品發酵過程中的品質形成和安全性控制等諸多技術問題產生革命性的影響。

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Progress of toxic metabolite analysis in fermented food by metabolomics

MIAO Lu-huan,DU Jing-fang,BAI Feng-ling*,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China)

Some toxic metabolites were produced during the process of food fermentation,which caused safety problems to fermented food. As a new technology,metabolomics can analyze and monitor small molecule metabolites of biological metabolism in real time. Technologies of gas chromatogram-mass spectrometry(GC-MS),ion chromatography(IC),reversed-phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC),HPLC-MS/MS and liquid chromatography-high resolution time of flight mass spectrometer(LC-ESI-TOFMS)were used to analyze toxic metabolites in food such as alcoholic beverage,wine,cheese,sausage,soybean sauce. The formation and changes of ethyl carbamate,biogenic amine and nitrite were analyzed at different fermentation period. It can provide references for increasing the safety of fermented food and promoting application in the field of fermented food.

metabolomics;fermented food;toxic metabolites;analysis

2015-06-05

繆璐歡(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品質量與安全控制，E-mail:maioluhuan2013@163.com。

白鳳翎(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品質量與安全控制和食品微生物學，E-mail:baifling@163.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD29B06)；遼寧省高等學校創新團隊課題(LT2014024)。

TS201

A

1002-0306(2016)05-0388-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.071