多重脅迫對嗜鹽四聯球菌CGMCC 3792存活率及細胞成分的影響

何桂強,馮　笑,吳重德,黃　鈞,周榮清

(四川大學輕紡與食品學院,皮革化學與工程教育部重點實驗室,四川成都 610065)

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多重脅迫對嗜鹽四聯球菌CGMCC 3792存活率及細胞成分的影響

何桂強,馮笑,吳重德*,黃鈞,周榮清

(四川大學輕紡與食品學院,皮革化學與工程教育部重點實驗室,四川成都 610065)

本研究以嗜鹽四聯球菌(TetragenococcushalophilusCGMCC 3792)為實驗菌株,考察了單因素(酸、熱、鹽)脅迫和交互保護對其存活的影響。結果表明,T.halophilusCGMCC 3792在pH4.0和45 ℃預適應處理60 min后細胞對酸致死脅迫(pH2.5,60 min)的存活率分別提高了10.6倍和8.8倍。此外,還考察了酸脅迫對細胞膜不飽和脂肪酸和胞內氨基酸含量的影響,結果表明,酸預適應后再經酸致死脅迫導致細胞膜不飽和脂肪酸18∶1n-9和18∶2n-6,9含量增加,分別是直接經酸致死脅迫的2.3倍和2.0倍;同時,分析胞內氨基酸含量,胞內谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和異亮氨酸濃度分別是直接經酸致死脅迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。研究結果將有助于進一步解析嗜鹽四聯球菌環境脅迫抗性的生理機制。

嗜鹽四聯球菌,環境脅迫,交互保護,膜脂肪酸,胞內氨基酸

嗜鹽四聯球菌(Tetragenococcushalophilus)的代謝產物乳酸等小分子有機酸,不僅能通過縮合反應與醇類產生酯類組分,賦予產品獨特的風味,而且能使體系的pH降低抑制有害微生物,如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等的生長[1-2]。因此,嗜鹽四聯球菌已廣泛應用于高鹽發酵調味品(醬油、魚露、豆醬)[3-5]的生產中。不同類型發酵調味品生產中,其鹽分、酸度、溶氧等參數控制有較大差異,波動范圍也不同。多重因素影響著T.halophilus的正常生理代謝,致使其難以充分發揮作用。由此可見,提高其對環境脅迫的抗性,具有重要意義。

目前對于提高微生物對環境脅迫抗性的策略主要有:一是從脅迫環境中直接篩選耐受菌株;二是根據微生物脅迫機理的研究定向改造微生物菌種,從而提高其耐受性[6]。然而在實際生產中,微生物所遇到的環境脅迫是復雜和交叉的,往往同時出現。因此,通過直接篩選的方法容易漏掉一些有應用潛力的耐受菌株,而對脅迫機理的研究卻逐漸成熟并為篩選耐受菌株提供了新的思路。Zhang等[7]發現在酸脅迫條件下干酪乳桿菌進化菌株比原始菌株積累更多的精氨酸,并通過外源添加精氨酸至L.casei酸脅迫培養基中,L.casei存活率顯著提高。已有的研究表明微生物經一種環境脅迫后對其他多種環境脅迫的抗性顯著提高,這種現象被稱為“交互保護”。交互保護作為細胞對環境脅迫中的一種應激反應,在提高微生物對環境脅迫的耐受性方面具有重要作用。薛峰等[8]研究了不同預適應條件對干酪乳桿菌ATCC393TM存活的影響,其中經pH4.0的鹽酸預適應90 min后,干酪乳桿菌ATCC393TM對熱脅迫(70 ℃,90 min)和氧脅迫(10 mol/L H2O2,90 min)的存活率分別提高了305倍和173倍。

本文以T.halophilusCGMCC 3792為研究對象,研究其在單因素脅迫和交互脅迫過程中細胞存活率的變化,并對細胞膜不飽和脂肪酸和胞內氨基酸進行了分析,旨在為提高其環境脅迫抗性以及工業應用奠定了理論基礎。

表1　單因素脅迫種類和脅迫條件Table 1　Types and conditions of stress in single-factor experiment

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜鹽四聯球菌(T.halophilusCGMCC 3792),實驗室從醬油醪中分離,經形態、生理生化特性實驗和16S rDNA測序鑒定,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

M17肉湯購于OXOID公司。種子培養基:M17肉湯,加入6% NaCl,補充終濃度為5 g/L的葡萄糖。脅迫培養基:M17肉湯,補充終濃度為5 g/L的葡萄糖,分別加入不同濃度的NaCl或鹽酸調節培養基的鹽濃度和pH。其他化學試劑均為分析純。

可見光分光光度計(Spectrumlab22PC)美國PerkinElmer公司;高速冷凍離心機(GL-20G-C)上海安亭科學儀器有限公;氣相色譜-質譜聯用儀(Trace DSQ II)美國Thermo公司;氨基酸分析儀(A300)德國默曼博爾公司。

1.2單因素脅迫實驗

先將種子培養液活化,然后以5%接種量接入M17培養基中,在30 ℃條件下靜置培養至OD600值為2.5時,取1 mL培養物離心(10000×g,4 ℃,5 min),然后用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,收集菌體重懸于等體積的脅迫培養基中(表1)。脅迫后的細胞用無菌生理鹽水離心洗滌后,稀釋成不同梯度,取10 μL稀釋液點種于M17平板中并進行菌落計數。

1.3交互保護實驗

依據1.2單因素脅迫實驗收集菌體,將菌體分別重懸在三種脅迫種類的預適應(pH4.0,60 min;45 ℃,60 min和6% NaCl,60 min)培養基中,預適應后的細胞用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,分別得到各預適應條件處理后的細胞,稀釋成不同梯度后取10 μL重懸液點種于M17培養基平板中并進行菌落計數。依據上述預適應處理后的菌體細胞在三種致死脅迫條件(pH2.5,60 min;55 ℃,60 min和36% NaCl,120 min)下進行處理,以前述方法點種于M17培養基平板中并計數。

1.4細胞存活率的計算

取10 μL菌液以不同稀釋度點種于M17培養基平板上測定單位體積菌落數(colony forming per unit,CFU/mL)。每個稀釋梯度均設3個平板為平行,將平板放置在30 ℃下培養36 h,計數菌落數。以pH6.8、30 ℃和0% NaCl處理得到的菌落數為100%的存活率,經酸、熱和鹽不同條件脅迫得到的菌落數分別與pH6.8、30 ℃和0% NaCl處理得到的菌落數之比即為不同條件脅迫的存活率。

1.5細胞膜脂肪酸成分的分析

分別取25 mL OD600為2.5的培養液依據1.2收集菌體,將菌體酸預適應處理(pH4.0,60 min)后,進行酸致死脅迫(pH2.5,60 min),測定干重(dry weight,DW)。細胞膜脂肪酸的提取和檢測參考文獻[9]。C9-C20的脂肪酸可根據各自的保留時間和質譜范圍在圖庫中進行查找,每個樣品重復測定3次。

1.6胞內氨基酸含量測定

取10 mL OD600值為2.5的培養液依據1.2收集菌體,將菌體酸預適應處理(pH4.0,60 min)后,進行酸致死脅迫(pH2.5,60 min),然后用無菌生理鹽水離心洗滌兩次,重懸于1 mL的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)中,置于沸水中煮沸15 min,離心(10000×g,4 ℃,10 min),取上清液。在上清液中加入100 μL 10%的磺基水楊酸,沉淀蛋白,然后經0.22 μm過濾器過濾后,用氨基酸分析儀測定,測定條件參考文獻[10]。細胞中游離氨基酸濃度由標準氨基酸校正計算。

1.7數據分析

本實驗的數據分析與制圖采用Origin 8.5,顯著性分析則采用SPSS 19.0進行。所有結果均有三次平行實驗。

圖1　酸脅迫(A)、熱脅迫(B)和鹽脅迫(C) 對嗜鹽四聯球菌CGMCC 3792存活率的影響Fig.1　Effect of acid(A),heat(B),and salt(C)stresses on the survival of T. halophilus CGMCC 3792

2　結果與討論

2.1單因素脅迫對菌株CGMCC 3792存活率的影響

pH、溫度、鹽濃度對T.halophilusCGMCC 3792存活的影響如圖1所示。pH在3.0～6.8的范圍時,pH降低使細胞存活率小幅度減少;然而,當pH從3.0降低到2.5時,其存活率從67.5%顯著降低到6.17%(圖1A)。溫度在30～40 ℃范圍變化時,對細胞存活率的影響較小,繼續提高熱處理溫度時,顯著影響其存活率,55 ℃時,存活率降至3.51%(圖1B)。在0%～36% NaCl濃度范圍內,隨其濃度增加,細胞存活率呈現下降的趨勢;但在36%NaCl鹽脅迫處理120 min后,其存活率仍在10%以上(圖1C)。

綜上所述,分別選取pH4.0、45 ℃和6% NaCl濃度處理60 min作為T.halophilusCGMCC 3792的酸、熱和鹽預適應條件;而pH2.5、55 ℃處理60 min和36% NaCl濃度處理120 min分別作為酸、熱和鹽脅迫的致死條件。

2.2交互保護對菌株CGMCC 3792存活率的影響

分別考察了細胞經預適應處理后再經致死脅迫的存活率變化。圖2為細胞分別經pH4.5、45 ℃和6% NaCl預適應處理60 min后,再經酸致死(pH2.5,60 min)、熱致死(55 ℃,60 min)和鹽致死(36% NaCl,120 min)脅迫,存活率的增加倍數。

圖2　預適應處理后嗜鹽四聯球菌CGMCC 3792 在酸(A)、熱(B)和鹽(C)致死條件下的存活率變化Fig.2　Survival rate of T. halophilus CGMCC 3792 under lethal acid(A),heat(B),and salt(C)stress after pre-adaptation注:圖柱上方星號表示與對照(不預適應) 比較具有顯著性差異(p<0.05)。

在酸致死脅迫中,與未經預適應的細胞相比,經酸、熱和鹽預適應處理后,細胞存活率分別提高了10.6倍、8.8倍和1.5倍(圖2A)。酸適應性反應是乳酸菌中常見的一種應激反應,酸預適應后,能誘導細胞的酸耐受反應機制,從而提高細胞在酸脅迫環境下的存活率。Hartke等[11]報道,乳酸乳球菌乳亞種細胞在pH5.5酸預處理30 min后,再經pH3.9的致死酸脅迫處理,其存活率比未經預適應的細胞顯著提高。在熱致死脅迫中,經熱和鹽預適應后,細胞存活率分別提高了2.3倍和2.1倍,而經酸預適應處理的細胞存活率與對照相比不增反降(圖2B)。鹽預適應處理后,細胞存活率提高可能與蛋白表達有關。有研究表明,L.lactis在遭遇鹽脅迫時,12種上調蛋白質都屬于熱脅迫應激蛋白[12]。此外,考察了預適應后對熱致死脅迫細胞存活率的變化,結果表明,經酸、熱和鹽預適應處理后,細胞存活率分別提高了2.2倍、3.0倍和2.3倍(圖2C)。熱預適應后,存活率的提高與熱脅迫應激蛋白密切相關。Broadbent等[13]曾報道了L.helveticusLH212在52 ℃預適應處理20 min后,再經歷63 ℃致死脅迫時與未經預適應處理的相比,細胞存活率提高了11倍,通過二維凝膠電泳分析,還檢測到了一些熱脅迫應激蛋白DnaK,GroEL,ClpB,GrpE,使細胞的耐熱性增強。

圖3　酸脅迫對細胞膜脂肪酸含量的影響Fig.3　Effect of acid stresson membrane fatty acids distribution.(A)saturated fatty acids, (B)unsaturated fatty acids 注:圖柱上方星號表示與對照(脅迫前) 比較具有顯著性差異(p<0.05)，圖4同。

2.3酸脅迫對細胞膜脂肪酸組分的影響

圖3所示為酸脅迫對細胞膜脂肪酸組分的影響。由圖可知,酸脅迫后,飽和脂肪酸含量(14∶0,15∶0,16∶0和20∶0)有所降低(圖3A);但是,與脅迫前相比的不飽和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)在酸預適應后增加,直接經酸致死脅迫后進一步增加(圖3B)。特別的是,經過酸預適應再經酸致死脅迫的不飽和脂肪酸含量(18∶1n-9和18∶2n-6,9)顯著增加,分別是直接經酸致死脅迫的2.3倍和2.0倍。調節細胞膜脂肪酸分布是細胞抵御環境脅迫的重要機制之一,細胞可以通過改變脂肪酸的組分來適應環境脅迫[14]。通過考察酸脅迫對細胞膜脂肪酸含量的變化得知,酸脅迫后引起飽和脂肪酸含量降低,而不飽和脂肪酸含量顯著升高,這與酸脅迫引起干酪乳桿菌細胞膜飽和脂肪酸(C14∶0,C15∶0,C16∶0)比例降低,而不飽和脂肪酸18∶1n-9和18∶1n-11都有不同程度的增加結果是一致的[15]。結果表明,增加不飽和脂肪酸含量是嗜鹽四聯球菌的一種酸存活機制。

2.4酸脅迫對胞內氨基酸含量的影響

酸脅迫對嗜鹽四聯球菌胞內氨基酸含量的影響,如圖4所示。酸預適應后,谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量降低幅度小;但是酸脅迫后,含量顯著降低,分別僅為脅迫前的20.8%、21.2%、15.3%和18.3%。特別的是,經過酸預適應后再應對酸致死脅迫的胞內氨基酸含量分別是直接經歷酸致死脅迫的2.5倍、2.4倍、2.2倍和2.7倍。

圖4　酸脅迫對胞內氨基酸含量的影響Fig.4　Effect of acid stress on intracellular pools of amino acid

在谷氨酸脫羧酶途徑中,脫羧反應不僅可以消耗胞內的H+,而且生成堿性略強的γ-氨基丁酸,因此,谷氨酸的積累能夠很好地阻止細胞內的pH降低,維持穩定的pH范圍[16]。此外,脫羧反應與電子傳遞的偶合可產生ATP及質子推動力也有利于細胞的存活。有研究報道,在外源添加天冬氨酸可以使L.casei在酸脅迫條件下(pH4.3)的生長性能和存活率顯著增加[17],表明酸脅迫條件下積累天冬氨酸含量可以提高細胞的酸耐受性能。亮氨酸和異亮氨酸作為支鏈氨基酸在胞內的積累是乳酸菌常見的一種酸應激反應[17],這是因為支鏈氨基酸的合成需要消耗丙酮酸和NADH,同時減少甲酸的含量,使胞內酸性減弱。因此,支鏈氨基酸的脫氨作用被認為是維持胞內pH穩定的一種機制[18]。

3　結論

本研究通過考察了嗜鹽四聯球菌在單因素脅迫和交互脅迫過程中細胞存活率的變化,并對酸脅迫處理后的細胞膜脂肪酸和胞內氨基酸進行了分析。研究發現,酸預適應處理與未經預適應的細胞相比,其在應對酸致死脅迫時存活率提高了10.6倍(圖2)。酸預適應后再經歷酸致死脅迫與直接經歷酸致死脅迫相比,細胞膜不飽和脂肪酸(18∶1n-9和18∶2n-6,9)和胞內氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸和亮氨酸)含量更高,可以提高其酸耐受性。上述研究結果有助于進一步認識嗜鹽四聯球菌抵抗環境脅迫的生理機制。

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Influence of multiple stresses on the survival and cellar constituent ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792

HE Gui-qiang,FENG Xiao,WU Chong-de*,HUANG Jun,ZHOU Rong-qing

(College of Light Industry,Textile & Food Engineering,and Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering,Ministry of Education,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

In this study,the influence ofsingle-stress(acid,heat,or salt)and cross-protection on the survival ofTetragenococcushalophilusCGMCC 3792 was investigated. The results indicated that cells were pre-adapted at pH4.0 or 45 ℃ for 60 min,and then acid challenged at pH2.5 for 60 min,and the survival rate increased 10.6-fold and 8.8-fold,respectively. Analysis of membrane fatty acids and intracellular amino acids in acid-adapted cells showed that unsaturated fatty acids18∶1n-9 and 18∶2n-6,9 were 2.3-fold and 2.0-fold higher than that in cells directly subjected to lethal acid stress,respectively. In addition,the intracellular concentrations of glutamate,aspartate,leucine,and isoleucinewere 2.5-fold,2.4-fold,2.2-fold and 2.7-fold higher than those in control cells,respectively. Results presented in this study may contribute to further elucidate the physiological mechanisms employed byT.halophilusduring environmental stresses.

T.halophilus;environmental stresses;cross-protection;membrane fatty acid;intracellular amino acid

2015-08-04

何桂強(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物生理學與生物化學，E-mail:guiqianghe@163.com。

吳重德(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物生理學與生物化學，E-mail:wuchongde@163.com。

國家自然科學基金(31301546);中央高校基本科研業務費專項資金(SCU2015D008)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.027