HPLC法同時測定黨參中5種核苷和堿基

王高峰

(貴州工程職業(yè)學院 生命科學系,貴州銅仁 565200)

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HPLC法同時測定黨參中5種核苷和堿基

王高峰

(貴州工程職業(yè)學院 生命科學系,貴州銅仁 565200)

建立了超聲輔助提取結合高效液相色譜(HPLC)測定黨參中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷含量的方法。黨參的最佳提取條件為:20倍量的純凈水超聲提取60 min,提取2次。采用Venusil MP C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)分離和測定目標分析物,流動相為甲醇-水梯度洗脫,檢測波長260 nm,體積流量1.0 mL/min,柱溫35 ℃。結果表明,5種化學成分的質量濃度與峰面積的線性關系良好(R2>0.9995),平均回收率為97.05%～101.08%,RSD≤3.01%。不同產(chǎn)地黨參核苷類成分含量有所差異,18個黨參樣品中胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷及核苷總量介于68.71～478.82、171.33～629.60、33.63～140.05、221.31～651.37、143.26～511.78、679.87～2011.67 μg/g之間。本研究所建立方法操作簡便,精密度、穩(wěn)定性和重復性良好,準確可靠,適用于黨參藥材中5種核苷和堿基成分的同時測定,為全面客觀地認識黨參藥材功效物質基礎、豐富和發(fā)展黨參藥材多指標評價體系研究提供科學依據(jù)。

高效液相色譜法,黨參,核苷,堿基

黨參(RadixCodonopsis)具有健脾益肺、養(yǎng)血生津等功效,為常用補氣中藥之一[1],現(xiàn)代藥理學研究證實,其水溶性成分具有顯著的抗胃潰瘍、抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓等多種生物活性[2],常用于冠心病、高脂血癥、調節(jié)胃腸功能、腫瘤等[3]患者的保健和治療作用。現(xiàn)行版中國藥典(2010年版一部)以黨參中醇溶性浸出物(45%乙醇)的含量來控制黨參藥材的質量,規(guī)定其質量分數(shù)不得少于55.0%,但未明確具體的指標成分,以此作為藥材質量控制標準過于籠統(tǒng)[1]。前期研究工作表明,黨參中含有腺苷[4]、尿嘧啶[5]等核苷類物質,而核苷類物質具有調節(jié)免疫功能、調節(jié)血糖、促進腸道修復、降低血壓、抗心律失常、抗缺血性損傷等生物活性[6],因此,本實驗通過HPLC法建立同時測定黨參中核苷及游離堿基成分的方法,對其成分進行定性定量分析,以期為全面客觀地認識黨參藥材物質基礎、豐富和發(fā)展黨參藥材多指標評價體系研究提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黨參新鮮根山西省平順縣青羊鎮(zhèn)老馬嶺村等地,每份樣品均取自30株成熟植株根以保證樣品代性,經(jīng)作者本人鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf. 的干燥根(表1),均為人工栽培樣品；甲醇色譜純，美國Fisher公司；其他試劑均為分析純；水娃哈哈牌純凈水。

尿苷對照品、腺嘌呤對照品、腺苷對照品(批號:110887-200202、886-200001、110879-200202)中國食品藥品檢定研究院;胞苷對照品、鳥苷對照品南京都萊生物技術有限公司,純度大于98%。

LC-20A型高效液相色譜儀日本島津,PDA檢測器;DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱上海博訊實業(yè)有限公司;SB-5200DTN型超聲波清洗機寧波新芝生物科技股份有限公司;TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;CP225D型分析天平德國Sartorius公司。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件色譜柱:VenusilMP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A相為甲醇,B相為水,進行梯度洗脫(0 min,1% A;10 min,5% A;15 min,15% A;21 min,17% A;25 min,20% A;30 min,24% A);檢測波長:260 nm;體積流量:1.0 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:35 ℃。

1.2.2對照品溶液的制備分別精密稱取減壓干燥至恒重的胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷對照品適量,加純凈水溶解并制成質量濃度分別為0.58、0.55、0.55、0.55、0.59 mg/mL的對照品貯備液,備用。

1.2.3供試品溶液的制備精密稱取黨參粉末(過50目篩)1.0 g,置50 mL具塞錐形瓶中,精密加純凈水20 mL,室溫下超聲提取60 min(超聲功率600 W,工作頻率40 kHz),放至室溫,搖勻,倒入離心管中,4000 r/min離心10 min,過濾,重復操作1次,合并提取液,以純凈水定容至50 mL量瓶中,用前倒入離心管中,4000 r/min離心15 min,取上清液以0.45 μm 微孔濾膜濾過,即得。

1.2.4標準曲線、檢測限和定量限分別精密吸取各對照品貯備液適量,加純凈水定容至25 mL制成混合對照品溶液,胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷質量濃度分別為58.00、66.00、22.00、110.00、59.00 μg/mL,置于4 ℃的冰箱內,臨用前以0.45 μm微孔濾膜濾過。并逐級稀釋,得到一系列不同質量濃度的5種核苷混合對照品溶液,在1.2.1項條件下進行測定,以對照品的峰面積(y)對相應的質量濃度(x)進行線性回歸,得回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍;逐步稀釋各對照品溶液,按信噪比(S/N)約為3計算檢測限(LOD),以S/N約為10計算定量限(LOQ)。

1.2.5精密度實驗分別精密取含胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷58.00、66.00、22.00、110.00、59.00 μg/mL的混合對照品溶液,按1.2.1項條件下同一天內進樣6次,以測定的平均峰面積計算日內精密度;連續(xù)測定3 d,以測定的平均峰面積計算日間精密度。

1.2.6重復性實驗取同一黨參樣品6份(S16),按1.2.3項下條件制備供試品溶液,記錄其色譜峰面積,通過計算RSD以考察本方法的重復性。

1.2.7穩(wěn)定性實驗將配制好的供試品溶液(S16)在常溫條件下密閉放置,分別于0、2、4、8、12、24 h測定,記錄其色譜峰面積,通過計算RSD以考察本樣品的穩(wěn)定性。

1.2.8加樣回收率實驗精密稱取已知含量的黨參樣品約0.50 g(S16),共9份,分別精密加入胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷對照品貯備溶液適量,按1.2.3項下條件制備供試品溶液,驗證本方法的準確性,計算加樣回收率。

1.2.9樣品含量測定制備18批樣品溶液,平行3份,測定其5種核苷和堿基的含量。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2　結果與討論

2.1色譜條件的選擇與優(yōu)化

核苷和堿基類化合物極性大,較難分離,本實驗比較了以下4種色譜柱Innoval AQ C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),Venusil XBP C18(L)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),Durashell C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Venusil MP C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。實驗結果表明,Venusil MP C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)對5種核苷和堿基類成分達到了良好的分離,第2～3種色譜柱不能很好的分離5種核苷和堿基類成分,而第1種色譜柱峰形較差。同時比較了不同的流動相組成如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-甲酸水溶液和甲醇-甲酸水溶液對樣品的分離效果,發(fā)現(xiàn)甲醇-水做流動相時分析物的分離效果較好。因此最終選擇了Venusil MP C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫。在190～400 nm下用PDA檢測器對混合對照品進行光譜掃描并保存全光譜,可以觀測到胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷在260 nm處都有較大的吸收峰,故選擇260 nm作為其檢測波長。按照1.2項條件下色譜條件進行分析,各成分分離度良好,對照品和樣品色譜圖見圖1。

表3　對照品的線性關系和范圍Table 3　Linearity and ranges of control products

圖1　對照品(A)及S16號樣品(B)的HPLC圖Fig.1　HPLC fingerprinting of control products(A)and S16 sample(B)注:1.胞苷;2.尿苷;3.腺嘌呤;4.鳥苷;5.腺苷。

2.2提取條件的選擇與優(yōu)化

目前文獻中多采用回流提取法[7]和超聲提取法[8],本實驗考察了這2種方法,以獲得最佳的提取效率。結果表明,黨參中5種成分的總量平均值超聲提取法(1186.10±0.01 μg/g)顯著高于回流提取法(593.04±0.09 μg/g),故選擇超聲提取法。以5種核苷和堿基的總量為考察指標,選取甲醇和水的體積比(A)、提取時間(B)、溶劑用量(C)和提取次數(shù)(D)為考察因素,采用L9(34)正交實驗設計進行實驗(表2)。由表2可知,供試品最佳提取工藝為加20倍量的純凈水超聲提取2次,每次60 min。

表2　超聲提取正交實驗結果Table 2　Results of orthogonal experiment of ultrasonic extraction

2.3標準曲線、檢測限和定量限

結果表明,胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷質量濃度分別在0.58～58.00、0.66～66.00、0.22～22.00、1.10～110.00、0.59～59.00 μg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系,相關系數(shù)達到0.9995以上,結果見表3。

2.4精密度實驗

胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷日內精密度RSD分別為0.97%、0.86%、1.10%、1.05%、0.84%,其日間精密度RSD分別為1.37%、1.46%、1.23%、1.51%、1.84%。結果表明,以胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷所建立的高效液相色譜法及檢測儀器檢測時精密度良好。

2.5重復性實驗

胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量分別為227.60±0.09、330.08±0.03、83.36±0.04、362.08±0.02、252.24±0.04 μg/g,RSD分別為2.29%、1.50%、1.24%、1.83%、1.79%,表明該方法的重復性較好。

2.6穩(wěn)定性實驗

胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷色譜峰面積的RSD分別為2.76%、1.91%、2.65%、2.38%、2.63%,說明供試品溶液至少在24 h內穩(wěn)定。

2.7加樣回收率實驗

黨參(S16)中5種核苷和堿基的平均回收率在97.05%～101.08%,RSD 1.19%～3.01%,符合分析要求,結果見表4。表明上述實驗方法的準確度較高,能應用于黨參中核苷和堿基類活性成分的檢測與分析。

2.8樣品的含量測定

按外標兩點法定量,分別計算胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷的含量,結果見表5。

由表5可知,18批黨參藥材均含有胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷成分,表明不同產(chǎn)地黨參中核苷和堿基類成分較為相似。18批黨參樣品的含量測定結果顯示:胞苷、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、腺苷及核苷總含量分別在范圍68.71～478.82、171.33～629.60、33.63～140.05、221.31～651.37、143.26～511.78、679.87～2011.67 μg/g,平均含量分別為222.36、369.11、55.72、458.20、333.96、1440.82 μg/g。表明不同產(chǎn)地黨參藥材中各核苷和堿基的含量具有明顯差異,產(chǎn)于山西省平順縣龍溪鎮(zhèn)和杏城鎮(zhèn)的黨參品種含量較高,也與其歷來黨參(潞黨)的道地產(chǎn)區(qū)相映證[9]。同時作者也發(fā)現(xiàn)相同種植區(qū)的不同種植基地的黨參藥材中核苷和堿基的含量也有一定差異,這是否與環(huán)境條件、栽培技術、田間管理等有關[10-11]。因此,進行黨參栽培時,栽培基地的選擇對黨參的品質形成具有重大影響,文中實驗結果將對黨參的栽培基地選擇具有一定的指導意義。

同時,本文對平順縣虹梯關鄉(xiāng)界畔峧村的不同生長年限中核苷和堿基化合物的測定表明,胞苷和腺嘌呤隨著生長年限的增加而增加,與王愛娜[12]對黨參中蒼術內酯Ⅲ的研究結果相一致,而尿苷、鳥苷、腺苷及核苷總量隨著生長年限呈現(xiàn)遞減的趨勢,與王秀文[13]對黨參中黨參炔苷等化合物的研究結果類似,進一步表明生長年限對黨參化學成分有顯著性影響。本研究中不同生長年限的黨參樣本量較少,為了進一步證實不同生長年限黨參與其品質形成的相關性,后續(xù)研究將采集更多的黨參藥材樣本進行系統(tǒng)研究。

樣品山西省平順縣東寺頭鄉(xiāng)秦光村(S5)栽培過程中使用壯根靈導致其核苷和堿基含量顯著低于其他樣品,與陳玉武[14]對黨參栽培過程中噴施黨參壯根靈而降低黨參炔苷含量的研究結果類似,全面評價壯根靈對黨參藥材品質的影響有待進一步研究。

結果表明,不同產(chǎn)地的黨參藥材質量差異較大,故有必要對黨參藥材的質量進行評價,以往對黨參的質量控制研究報道很多,但至今尚無統(tǒng)一規(guī)范的質量控制方法,本方法可作為《中國藥典》質量標準的定量評價指標之一,該方法也為黨參生產(chǎn)過程中產(chǎn)地環(huán)境選擇、農藝措施提供了新的分析方法和依據(jù)。

3　結論

黨參在民間傳統(tǒng)用法是水煎劑,本文采用HPLC-UV方法,根據(jù)樣品峰最大吸收波長和保留時間鑒定了黨參中的5個化合物,結果表明,黨參有紫外吸收的水溶性成分主要是核苷和堿基化合物。黨參所含核苷和堿基化合物可作為該藥材質量評價的指標性成分之一,核苷和堿基化合物已被證實是重要的生物活性物質,與黨參藥效(增強免疫功能、降血糖、降血壓等)具有一定的關聯(lián)性。鑒于核苷和堿基類成分在黨參藥材中含量為679.8672～2011.6720 μg/g,進一步探討以其含量高低作為黨參藥材質量優(yōu)劣的衡量指標,很有必要。本方法操作簡便,精密度、穩(wěn)定性和重復性良好,結果穩(wěn)定可靠,可作為黨參藥材的一個重要鑒別和質量評價手段之一,同時為闡明黨參及其相關制劑的藥理作用和質量綜合評價提供了堅實的基礎。

表4　加樣回收率實驗結果(n=3)Table 4　Results of the recovery rate test(n=3)

表5　不同產(chǎn)地黨參藥材中核苷和堿基的含量測定(μg/g,n=3)Table 5　Contents determination of nucleosides and bases in Radix Codonopsis materials from different producing areas(μg/g,n=3)

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Simultaneous determination of five nucleosides and bases inRadixCodonopsisby high performance liquid chromatography

WANG Gao-feng

(Department of Life Sciences,Guizhou Engineering Vocational College,Tongren 565200,China)

Ultrasonic assisted extraction and methods of HPLC were established to determine cytidine,uridine,adenine,guanosine and adenosine inRadixCodonopsis. The best extraction condition for Radix Codonopsis was 20 times the amount of pure water to extract by ultrasonic for 60 min,and repeat it for 2 times. Samples were separated and determined by a Venusil MP C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)using methanol-water system as mobile phase. Flow rate was 1.0 mL·min-1,and detection wavelength for fingerprinting was 260 nm with 35 ℃ for column temperature. Mass concentration of 5 components had good linear relation with peak areas(R2>0.9995). And average recovery rates were from 97.05% to 101.81% with RSD ≤ 3.01%. The contents of nucleosides inRadixCodonopsisfrom different producing areas were different. The contents of cytidine,uridine,adenine,guanosine,adenosine and total nucleosides in 18 samples were listed as the followings:68.71～478.82,171.33～629.60,33.63～140.05,221.31～651.37,143.26～511.78 and 679.87～2011.67 μg/g. The method in this study was easily performed with good precision,stability and reproducibility,accurate and reliable,so it was suitable to simultaneously determine the 5 components of nucleosides and bases inRadixCodonopsis. This provide scientific basis for objectively recognizing material basis of pesticide effect ofRadixCodonopsisand developing multi-index evaluation system.

HPLC;RadixCodonopsis;nucleosides;bases

2015-07-15

王高峰(1979-)，男，本科，講師，主要從事生物制藥的教學與研究工作,E-mail：80887665@qq.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)05-0315-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.055