性腺激素水平的尿樣測定

李曉楠川北醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，四川南充　637100

性腺激素水平的尿樣測定

李曉楠
川北醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，四川南充637100

性腺激素是生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的生理指標(biāo)之一，其測定樣品和技術(shù)對(duì)科學(xué)研究及臨床實(shí)踐至關(guān)重要。此文介紹了尿液作為測定性腺激素樣品的優(yōu)越性及可行性，并分析了常用的尿樣測定關(guān)鍵方法技術(shù)，以期為尿樣性腺激素測定技術(shù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)作為非損傷性研究的重要補(bǔ)充。

尿液，性腺激素，激素測定

［Abstract］Gonadal hormone is one of the important physiological indexes of reproductive endocrine system.Sample and technology are crucial for scientific research and clinical practice.This paper introduces the superiority and feasibility of gonadal hormone assay with urine samples，and analyzes its key measurement techniques，hoping to provide scientific basis for the development of gonadal hormone measurement and become an important supplement to the nondamage research.

［Key wordst］Urine；Gonadal hormone；Hormone assay

人類生殖功能和動(dòng)物繁殖行為的外在表現(xiàn)均依賴于體內(nèi)生殖激素的調(diào)控，生殖激素的調(diào)控作用受到機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，其中最為重要的是下丘腦-垂體-性腺軸，而該軸主要的生殖調(diào)控功能是通過性腺分泌的性腺激素來實(shí)現(xiàn)的。性腺激素主要包括三種，即雄激素、雌激素和孕激素，三者均為甾體類激素，是調(diào)節(jié)動(dòng)物和人類生殖行為最重要的性腺激素。因此，研究這三種性腺激素的分泌水平是研究動(dòng)物生殖功能及其行為的重要內(nèi)容，同時(shí)也是臨床中治療生殖障礙的重要監(jiān)測手段之一。此文總結(jié)分析性腺激素尿樣測定的可行性及樣本優(yōu)勢，同時(shí)對(duì)常用的尿樣前處理方式及測定技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為尿樣性腺激素測定技術(shù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)作為非損傷性研究的重要補(bǔ)充。

1　尿樣測定性腺激素的優(yōu)越性及可行性分析

性腺激素主要通過血液發(fā)生調(diào)節(jié)作用，因此大多研究都以血樣作為首選。但是隨著動(dòng)物研究的廣泛性和生殖類激素的廣泛使用，尿液也成為重要的研究樣本。首先，在動(dòng)物研究中需要采集大量連續(xù)血樣標(biāo)本時(shí)，由于頻繁采血，對(duì)動(dòng)物的傷害性極大。特別是對(duì)于小型、敏感型動(dòng)物，采血活動(dòng)是外界對(duì)研究動(dòng)物的應(yīng)激源，會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生心理及生理影響，甚至?xí)绊懙窖芯拷Y(jié)果。再者，對(duì)于珍稀瀕危動(dòng)物，生殖周期研究較少，無全周期激素動(dòng)態(tài)測定，飼養(yǎng)繁殖相對(duì)困難，在無參考的情況下頻繁利用血樣檢測性腺激素水平無疑是對(duì)這些動(dòng)物的重大刺激，甚至?xí)斐蓜?dòng)物的死亡。第三，如果研究對(duì)象是野生動(dòng)物，采集血樣更為不易，如何利用激素水平測定監(jiān)控野生動(dòng)物的生殖狀況是很多研究學(xué)者面臨的又一個(gè)難題。綜合以上原因，血樣已不再是性腺激素水平測定的首要選擇，加之生殖激素的高效性，機(jī)體內(nèi)源性腺激素濃度低，干擾大，對(duì)激素檢測技術(shù)要求較高，因此動(dòng)物尿樣、糞樣成為性腺激素檢測的重要樣本來源。

在性腺激素測定方面，相比較糞樣標(biāo)本，尿樣有更多優(yōu)勢。糞便中成分復(fù)雜，多含有食物纖維，對(duì)樣品的前期處理更為復(fù)雜［1］。另外，性腺激素及其代謝產(chǎn)物在糞便和尿液中出現(xiàn)分泌峰的時(shí)間相差甚遠(yuǎn)。在非人靈長類動(dòng)物中的研究顯示，將3H標(biāo)記的性腺激素注入狒狒體內(nèi)后，性腺激素在糞樣和尿樣中的分泌峰分別比血樣滯后36.4和4.5 h［2］。這就說明糞樣采集更耗時(shí)，等待采集樣品期間不可控因素增多，可能給檢測帶來更大誤差，而尿樣檢測耗時(shí)較短，更利于研究工作。

尿液之所以可以成為性腺激素水平測定的樣本是因?yàn)槟蛞褐械男韵偌に貪舛扰c血液中性腺激素濃度呈正相關(guān)。性腺激素在血液中發(fā)揮其生物學(xué)功能的時(shí)間很短，一般只有幾分鐘，最后都在肝臟內(nèi)滅活。激素滅活即是將血液中的性腺激素經(jīng)過降解和清除，使血液中的激素活性降低。激素滅活的過程主要包括對(duì)激素依次進(jìn)行的羥化、硫酸酯化或者糖醛酸結(jié)合成鈍化形式等代謝過程，隨后經(jīng)排泄物排出體外。研究顯示，注射放射性雌二醇后，尿中可回收65%，其中20%為雌二醇，其余為雌二醇的代謝產(chǎn)物［3］。因此，尿液作為性腺激素的檢測樣本是可行的，同時(shí)為非損傷研究方法作了重要補(bǔ)充。

2　尿樣前處理技術(shù)

在性腺激素測定之前，對(duì)尿樣進(jìn)行前期處理能夠保證測定結(jié)果的精準(zhǔn)性。尿樣前處理是經(jīng)過不同方式的分離純化、有機(jī)溶劑抽提分離、甚至層析、萃取等方式去除尿樣中的干擾物質(zhì)，提高待測物質(zhì)的測定準(zhǔn)確性。于小杰等總結(jié)分析了大熊貓尿液類固醇激素測定的前處理方式，提出不同的尿樣處理方式會(huì)影響所測定的性腺激素的含量值，而且不同處理方式所得出的研究結(jié)果間并無可比性［4］。目前，對(duì)于尿液激素測定的前處理并無統(tǒng)一認(rèn)可的技術(shù)，因此比較不同處理方式并遴選出最優(yōu)方式是尿樣性腺激素測定的關(guān)鍵。

尿液作為性腺激素的測定樣本尚不廣泛，主要的尿樣前處理方法基于有機(jī)溶劑提取、層析及萃取技術(shù)原理，常用的有機(jī)溶劑為乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等。在所有前處理方法中，首先需要對(duì)尿樣進(jìn)行酶解，促使結(jié)合態(tài)的性腺激素及其代謝物由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，常用的酶解溶劑為葡萄糖醛酸脫氫酶。有學(xué)者認(rèn)為單純的有機(jī)溶劑抽提并不能完全將干擾物質(zhì)分離出去，因此在有機(jī)溶劑抽提的基礎(chǔ)上加上不同層析純化技術(shù)，提高了測定的準(zhǔn)確性［5］。有研究顯示，尿樣標(biāo)本冷凍解凍后再離心經(jīng)固相萃取柱萃取，提取回收率可達(dá)到90%以上，去除尿液標(biāo)本中硫酸鹽和磷酸鹽等雜質(zhì)，成功檢測尿液中多種內(nèi)源性類固醇激素［6］。因此，不同的前處理方法對(duì)性腺激素的測定具有重大影響，選取合理的純化溶液尤為重要，多種前處理方法的聯(lián)合使用可能會(huì)提高尿樣的前處理效果。

3　尿樣性腺激素測定技術(shù)

在川金絲猴的研究中，作者利用酶聯(lián)免疫吸附測定法，購買商用酶免試劑盒成功檢測出川金絲猴尿液中雌二醇、孕酮和睪酮的含量［7］。放射免疫法是以放射性核素為標(biāo)記的免疫分析技術(shù)，常用于臨床血樣檢測，是目前最常用的尿樣激素檢測技術(shù)。但有研究顯示，因尿液中的雌激素及其代謝物的結(jié)構(gòu)很相似，以免疫學(xué)為原理的各種技術(shù)不能同時(shí)檢測雌激素和代謝物，只適用于檢測激素總體水平［8］。除此之外，Access化學(xué)發(fā)光儀也被應(yīng)用于人類尿液睪酮含量的測定，結(jié)果顯示Access化學(xué)發(fā)光儀可用于測定尿液睪酮，但須與血清同時(shí)進(jìn)行測定結(jié)果更具參考價(jià)值［9］。近些年來，在生物檢測中，質(zhì)譜聯(lián)合色譜技術(shù)因?yàn)槠涑`敏性而被廣泛應(yīng)用。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)隨著該技術(shù)的發(fā)展需要，主要有以下幾種：GC/MC（氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用）、HPLC/MS（高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用）、GC/MS/MS、HPLC/MS/MS［10］。這些技術(shù)同時(shí)應(yīng)用于奧運(yùn)會(huì)運(yùn)動(dòng)員的尿樣興奮劑的檢測中［11］。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)上樣樣品要求較高，一般需要復(fù)雜的前處理步驟［12］。目前有固相萃取、分散液液微萃取、濁點(diǎn)萃取、鹽析輔助液液萃取等多種方法。

綜上可知，目前動(dòng)物尿樣性腺激素常用的測定技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫法、放射免疫法、高效氣相色譜聯(lián)合質(zhì)譜和高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)。針對(duì)不同物種和不同采集、保存及前處理的尿液樣本，如何正確選取測定技術(shù)是研究工作和臨床實(shí)踐的關(guān)鍵。因此，作者對(duì)以上幾種常用尿樣性腺激素技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表1。雖然放射免疫法具有輻射污染，測定結(jié)果不易自動(dòng)分析，但是該方法適合于少量樣本測定，對(duì)于取樣困難的研究，此方法有明顯的優(yōu)勢。在實(shí)際測定過程中可以通過規(guī)范操作步驟，試劑盒現(xiàn)用現(xiàn)購等方式將輻射降低至最低。相比較而言，酶聯(lián)免疫法對(duì)工作人員的安全性更高，可以批量樣本測定，但是因?yàn)楸痉椒ǜ蓴_性大，因此對(duì)抗體的靈敏度有較高要求。高效氣相（液相）色譜聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)具有前兩種檢測方法的諸多優(yōu)點(diǎn)，例如靈敏度高，檢測準(zhǔn)確度更高，對(duì)人身健康無危害，但是因該技術(shù)需要的儀器設(shè)備更加精密，操作更加復(fù)雜，對(duì)操作人員的技術(shù)要求更高，同時(shí)測定更耗時(shí)，且不能批量檢測。因此，在實(shí)際研究工作中，合理選取激素檢測方法時(shí)應(yīng)基于不同技術(shù)的優(yōu)勢和劣勢。為了降低測定誤差，今后可以加強(qiáng)技術(shù)研究，盡量克服其缺點(diǎn)，促進(jìn)這些測定技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

表1　性腺激素水平測定技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

無論哪一種性腺激素檢測方法，為了避免尿液水分含量差異影響尿液中激素濃度，通過測定尿液肌酐（Creatinine，Cr）值進(jìn)行修正已經(jīng)是一種常用且成熟的方法。將激素濃度表示方法換算為每毫克肌酐中激素含量，即ng激素/mg肌酐（ng/mg Cr）。最常用的測定尿液肌酐的方法為苦味酸法，其測定原理是肌酐在強(qiáng)堿中與苦味酸作用產(chǎn)物為橙黃色，通過分光光度計(jì)即可測定吸光值［13］。

4　總結(jié)與展望

綜上所述，尿液中性腺激素及其代謝產(chǎn)物含量與血液中呈現(xiàn)正相關(guān)，因此尿液具有成為性腺激素含量測定樣品的生理基礎(chǔ)。同時(shí)性腺激素尿樣檢測作為一種非損傷研究方法，不僅減少了對(duì)機(jī)體的刺激應(yīng)激，同時(shí)更加適用于連續(xù)大量采樣、生殖周期動(dòng)態(tài)監(jiān)測等研究工作中，具有血樣不可比擬的優(yōu)勢。目前已有有機(jī)溶劑提取、層析、萃取等多種尿液前處理方法和酶聯(lián)免疫法、放射免疫發(fā)、色譜、質(zhì)譜等多種尿樣性腺激素檢測技術(shù)，但是尿樣前處理技術(shù)不夠成熟，多種前處理方式所得結(jié)果并無可比性，檢測技術(shù)精準(zhǔn)度有待提高。

基于以上尿樣性腺激素測定的研究現(xiàn)狀，該領(lǐng)域的深入研究可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。首先，深入研究尿液代謝規(guī)律，分析尿樣中性腺激素及其各級(jí)代謝產(chǎn)物出現(xiàn)的時(shí)間及比例，有助于提高檢測分析的準(zhǔn)確性。其次，在尿樣的前處理方式上，采用合理的純化溶劑及多種技術(shù)聯(lián)用都將提高尿樣的純化效果，提高尿液前處理技術(shù)，為提高檢測精準(zhǔn)度提供基礎(chǔ)。最后，尿樣前處理技術(shù)統(tǒng)一化，增加不同物種、不同研究間結(jié)果的可比性研究，更好促進(jìn)性腺激素尿樣檢測技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

［1］郭東.秦嶺川金絲猴（Rhinoyithecus roxellana）性激素水平與繁殖行為關(guān)系研究［D］.陜西：西北大學(xué)，2015.

［2］Wasser SK，Monfort SL，Southers J，et al.Excretion rates and metabolites of oestrodiol and progesterone in banboon （Papio cynocephalus cynocephalus）faecus［J］.J.Reprod. Fert，1994（101）：213-220.

［3］Hartman TJ，Sisti JS，Hankinson SE，et al.Alcohol Consumption and Urinary Estrogens and Estrogen Metabolites in Premenopausal Women［J］.Horm Cancer，2016，7（1）：65-74.

［4］于小杰，胡德夫，吉晟男，等.大熊貓尿液類固醇激素研究現(xiàn)狀及展望［J］.四川動(dòng)物，2012，5（31）：844-847.

［5］袁志杰，楊柳，鄭文杰，等.膠體金免疫層析技術(shù)的研究現(xiàn)狀與前景［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，1（36）：84-85.

［6］劉慧燕.固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測尿液中多種內(nèi)源性類固醇［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2015，1（6）：310-314.

［7］范鵬來，陳浩春，姚輝，等.神農(nóng)架川金絲猴糞便和尿液中類固醇激素的檢測［J］.獸類學(xué)報(bào)，2013，33（3）：286-292.

［8］陳春，于嘉屏.尿液雌激素和代謝產(chǎn)物檢測方法學(xué)比較及臨床應(yīng)用［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，7（36）：969-972.

［9］桂勇，廖朝青，夏琴.Access化學(xué)發(fā)光儀測定尿液睪酮的可行性分析［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2015，1（33）：51-52.

［10］陸燁.基于液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定內(nèi)源性激素的方法研究［D］.上海：復(fù)旦大學(xué).2013.

［11］高照，官凌菊，趙君軍，等.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)運(yùn)動(dòng)員尿液中內(nèi)源性類固醇水平特征的研究［J］.藥物分析雜志，2016，4（36）：645-654.

［12］姚軍，李敏，王磊，等.天然雌激素色譜-質(zhì)譜檢測方法研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用化工，2015，6（44）：1122-1126.

［13］王凱，彭珊茁，鄭曉梅，等.肌酐酶法與堿性苦味酸法測定尿中肌酐含量的對(duì)比分析［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2013，10（8）：112-113.

Urine Assay of Gonadal Hormone Levels

LI Xiao-nan
North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan Province，637100 China

R446

A

2096-1782（2016）08-0163-03

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.08.163

李曉楠（1987.1-），女，河南南陽人，碩士，助教，研究方向：生殖生理學(xué)。

2016-05-05）