川陳皮素后處理減輕心肌缺血再灌注損傷時細胞凋亡

陳 才，吳繼雄，王 靚，何 非

?

川陳皮素后處理減輕心肌缺血再灌注損傷時細胞凋亡

陳 才1，吳繼雄1，王 靚2，何 非1

目的 研究川陳皮素后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制。方法 選擇健康雄性C57BL/6小鼠48只，隨機均等分為4組：假手術組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、川陳皮素后處理組（NOB組）、川陳皮素后處理+PI3K特異性抑制劑LY294002組（NL組）。通過結扎小鼠左冠狀動脈前降支30 min，再灌注120 min，制作小鼠心肌缺血再灌注模型。采用Evans Blue和TTC雙重染色法測量心肌缺血危險區及梗死區面積；TUNEL染色法檢測各組小鼠心肌細胞凋亡指數；硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）濃度，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；Western blot檢測各組心肌的Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達量，計算Bcl-2/Bax比值。結果 與Sham組相比，I/R組心肌梗死面積及心肌細胞凋亡顯著增加，心肌Akt、Bcl-2下調，Bax、Caspase-3上調，Bcl-2/Bax下降，MDA顯著升高，SOD顯著降低（P＜0.001）。與I/R相比，NOB組心肌梗死面積、心肌細胞凋亡顯著減少，心肌Akt、Bcl-2上調，Bax、Caspase-3下調，Bcl-2/Bax升高，MDA顯著降低，SOD顯著升高（P＜0.001）。與NOB組相比，NL組心肌梗死面積及凋亡顯著升高，心肌Akt、Bcl-2下調，Bax和Caspase-3上調，Bcl-2/Bax下降，MDA顯著升高，SOD顯著降低（P＜0.001）。結論 川陳皮素可減輕心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡，其機制與PI3K-Akt通路激活降低氧化應激有關。

川陳皮素；PI3K/Akt；心肌缺血再灌注；凋亡

網絡出版時間：2016-6-6 13：52：31 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.012.html

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）多是由于冠狀動脈內膜損傷、血小板聚集或痙攣引起血栓形成導致冠狀動脈急性閉塞。及時有效恢復冠脈血流可挽救損傷心肌，但隨后的再灌注可進一步加重缺血心肌細胞損傷；藥物后處理在再灌注早期作為輔助性治療在臨床過程中減輕心肌缺血再灌注治療有良好前景。川陳皮素來源于蕓香科植物橘及栽培變種的成熟果皮，有有效的藥物活性，被普遍使用［1］。近期研究［2-3］顯示，川陳皮素可通過降低腦細胞凋亡從而減輕腦缺血及腦缺血再灌注損傷。川陳皮素藥理學作用逐步被人們發現，但川陳皮素對于心肌缺血再灌注是否有影響及其機制暫無相關研究。該實驗評估川陳皮素后處理對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其與PI3K/Akt信號通路的關系。

1　材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性C57BL/6小鼠48只，10 ～12周，22～28 g，購自安徽醫科大學動物實驗中心［SCXK（皖）2011-002］；本實驗所用動物和實驗操作經過安徽醫科大學倫理委員會批準。

1.2主要試劑及儀器 川陳皮素（陜西慧科植物開發有限公司，純度超過98%，溶于生理鹽水包含0.5%Tween 80中配成比例為10 mg/10 ml）；TTC（氯化三苯基四氮唑）、Evans Blue（伊文氏藍）（美國Sigma公司）；LY294002［美國BIOMOL Research Laboratories（Plymouth Meeting，PA）公司］；TUNEL凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche Diagnostics公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3（美國Cell Signaling Technologies公司）；羊抗兔二抗（武漢博士德生物科技有限公司）；BL-420E生物信號采集分析系統、動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）。

1.3小鼠心肌缺血/再灌注模型 動物適應性喂養1周，實驗前禁食12 h，不限飲水；隨機分為4組（n =12）。假手術組（Sham組）：僅過線不結扎；缺血再灌注組（I/R組）：小鼠左前降支結扎30 min，隨后松開結扎再灌注120 min；川陳皮素后處理組（NOB組）：缺血30 min，再灌注前5 min予以頸靜脈注射川陳皮素15 mg/kg；川陳皮素后處理+LY294002組（NL組）：再灌注5 min予以尾靜脈注射LY294002 0.3 mg/kg，再灌注5 min予以頸靜脈注射川陳皮素15 mg/kg。按照既往方法［4］構建小鼠心肌缺血再灌注模型。利用1%戊巴比妥鈉（0.6 ml/100 g）腹腔麻醉，然后小鼠固定解剖臺，四肢連接心電圖機；予以頸部皮膚消毒剪毛，氣管插管，接動物呼吸機。第三或第四肋間距胸骨左緣0.5 cm逐層解剖小鼠胸腔，剪開心包，以伴行的左冠狀靜脈主干為標記，在左心耳下約2 mm處用8-0無損傷縫合線穿過，以PE-10軟管墊于縫合線上，結扎冠脈前降支30 min，可見缺血心肌變白，心電圖出血ST段抬高，造成心肌缺血30 min。剪斷結扎線，心電圖可見ST回落及再灌注心律失常，缺血心肌由白色變紅。隨后關閉胸腔，持續再灌注2 h。

1.4TTC/Evans Blue染色 除Sham組外，于心肌再灌注120 min時，重新扎緊左冠狀動脈前降支，經頸靜脈注射1%伊文氏藍1 ml，可見染成藍色的為心肌非缺血區，未藍染的為心肌缺血區；心肌缺血區予以沖洗后濾紙吸干，-80℃冰凍10 min，沿心尖部垂直于心臟長軸切5片（厚為2 mm），置于1%的TTC溶液中，37℃水域鍋溫孵20 min，用福爾馬林固定，梗死心肌呈白色，缺血心肌呈紅色，進行掃描拍照。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（美國Merdia Cybernetics公司）測量缺血危險區面積和梗死區面積。

1.5TUNEL法測定心肌細胞凋亡 取左室缺血危險區心肌組織10%甲醛固定，常規石蠟包埋，每隔1 mm進行切片；按照 TUNEL試劑盒說明書以原位端口末端標記法檢測細胞凋亡；光鏡下（×400）觀察病理結果：凋亡陽性的細胞呈棕褐色。每張切片隨機選4個互不重疊高倍視野，采用圖像分析軟件計數凋亡細胞數和總細胞數。細胞凋亡指數（%）=凋亡細胞數÷細胞總數×100%。

1.6SOD活性和MDA濃度的測定 剪取左心室心肌，每50 mg心肌加入0.5 ml生理鹽水，再加入抑肽酶并煮沸10 min，3 000 r/min離心3 min后取上清液，-20℃保存。全部實驗結束后按照試劑盒說明書推薦的操作步驟測定血清T-SOD活性和MDA含量，于波長550 nm處測定各管吸光度（absorbance，A）值并計算SOD活性，波長532 nm處測定各管A值并計算MDA含量。

1.7Western blot檢測 Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3將心肌組織置于勻漿器中剪碎并勻漿，加400 μl單去污劑裂解液裂（含PMSF）置于冰上，裂解30 min后將裂解液移至1.5 ml離心管中，4℃12 000 r/min離心5 min，取上清液后采用BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白質電轉移到PVDF膜上，脫脂奶粉（TBST緩沖液配制）室溫封閉1 h，加入一抗（1∶1 000）4℃搖床孵育過夜，TBST緩沖液洗脫×3次后加入二抗（1∶100），室溫孵育2 h后TBST緩沖液洗脫3次，化學發光法（ECL）法顯影、定影并膠片曝光。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值。

1.8統計學處理 采用SPSS 13.0進行分析，計算資料以±s表示，組間資料的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。方差不齊者采用非參數檢驗，組間多重比較采用Tamhane法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1缺血/再灌注后心肌梗死面積顯著增加 與Sham組（2.88±0.45）%相比，I/R組（39.38± 2.04）%小鼠心肌梗死區面積顯著增加（χ2= 44.804，P＜0.001），兩組間缺血危險區面積差異無統計學意義（46.88%vs 47.04%，F=0.547，P= 0.965）。I/R組小鼠心肌凋亡指數（49.88± 6.99）%明顯高于Sham組（3.90±2.48）%（χ2= 36.098，P＜0.001）。表明本實驗成功建立了小鼠心肌缺血/再灌注模型。見圖1、2。

圖1　缺血/再灌注后心肌缺血危險區及梗死面積的變化（n=12）

圖2　缺血/再灌注后心肌凋亡指數的變化（n=12）

圖3　缺血/再灌注后心肌p-Akt表達水平的變化（n=12）

2.2缺血/再灌注后凋亡相關蛋白及氧化應激水平的變化 與Sham組相比，I/R組小鼠心肌磷酸化-Akt（p-Akt）的含量顯著下降，為Sham組的0.42倍（χ2=41.696，P＜0.001）；I/R組小鼠心肌Cleavedcaspase-3含量顯著增加，為Sham組的4.73倍（χ2=44.091，P＜0.001）。見圖3、4。與Sham組相比，I/R組小鼠心肌Bcl-2的含量顯著下降，Bax顯著增加，Bcl-2/Bax為Sham組的0.39倍（χ2=44.151，P ＜0.001）。見圖5。與Sham組（26.29±5.40 U/mg protein）相比，I/R組（5.06±2.06U/mgprotein）小鼠心肌T-SOD含量顯著降低（F=63.433，P＜0.001）；與Sham組相比，MDA的含量則顯著升高［（180.47±7.07）nmol/mg protein，F=1 011.629，P＜0.001］。

圖4　缺血/再灌注后心肌　Cleaved-caspase-3表達水平的變化（n=12）

圖5　缺血/再灌注后心肌　Bcl-2/Bax比值的變化（n=12）

2.3川陳皮素對缺血/再灌注后心肌梗死面積的影響及LY294002的拮抗作用 為明確川陳皮素后處理是否有心肌保護作用及其可能機制，檢測了I/R、NOB及NL組小鼠梗死區面積和缺血危險區面積。與IR組（38.69±2.25）%相比，NOB組（19.85± 2.84）%小鼠心肌梗死區面積顯著減小（χ2= 44.804，P＜0.001），而給予PI3K阻斷劑LY294002一定程度上可拮抗川陳皮素的保護作用，NL組（29.37±2.69）%心肌梗死區面積高于NOB組（P ＜0.001）。3組間缺血危險區面積的差異無統計學意義（P=0.965）。NOB小鼠心肌凋亡指數（32.11 ±9.42）%也明顯低于I/R（49.88±6.99）%（χ2= 36.098，P＜0.001），而LY294002處理組心肌凋亡指數（43.75±8.14）%也高于NOB組（P=0.023）。此結果說明川陳皮素后處理可以減少梗死區面積，減輕心肌細胞凋亡，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示川陳皮素后處理可能通過調節PI3K-Akt的表達而發揮心肌保護作用。見圖6、7。

圖6　川陳皮素對缺血/再灌注后心肌缺血危險區及梗死面積的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

2.4川陳皮素對缺血/再灌注后Akt、凋亡相關蛋白及氧化應激水平的影響及LY294002的拮抗作用為進一步明確川陳皮素后處理心肌保護作用的機制，檢測了I/R、NOB及NL組小鼠心肌Akt、凋亡相關蛋白的表達及氧化應激水平。NOB組小鼠心肌p-Akt含量是I/R組的5.51倍（P＜0.001），而NL組p-Akt的含量是NOB組的0.5倍（P＜0.001）。此外，NOB組小鼠心肌caspase-3含量是I/R組的0.33倍（P＜0.001），Bcl-2/Bax是I/R組的8.14倍（P＜0.001），而NL組caspase-3的含量是NOB組的1.92倍（P＜0.001），Bcl-2/Bax是NOB組的0.47倍（P＜0.001）。

NOB組小鼠心肌T-SOD含量（21.13±4.71 U/ mg protein）明顯高于I/R組（5.06±2.05 U/mg protein）（F=63.433，P＜0.001），而 NL組 T-SOD含量（11.66±3.57 U/mg protein）則低于NOB組（P＜0.001）。此外，NOB組小鼠心肌 MDA含量（89.14 ±7.34 nmol/mg protein）明顯低于I/R組（180.47± 7.07 nmol/mg protein，F=1 011.629，P＜0.001），而NL組MDA的含量（136.78±6.13 nmol/mg protein）則明顯高于NOB組（P＜0.001）。說明川陳皮素預處理通過上調Akt的表達、減輕氧化應激反應發揮心肌保護作用，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示Akt是川陳皮素心肌保護作用的重要效應通路。見圖8～10。

圖7　川陳皮素對缺血/再灌注后心肌凋亡指數的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

圖8　川陳皮素對缺血/再灌注后　Akt表達的影響及LY294002的拮抗作用（n=12）

圖9　川陳皮素對缺血/再灌注后　Bcl-2/Bax表達的影響及LY294002的拮抗作用（n=12）

3　討論

AMI是現今人類高致病和致死的主要病因之一，盡早恢復血流并維持缺血心肌氧和能量平衡對臨床有重大意義；PCI、溶栓及 CABG是主要的恢復血流方法，但研究顯示再灌注期間心肌細胞面臨著二次損傷，即為缺血再灌注損傷；凋亡在心肌缺血/再灌注損傷過程中起著重要作用，缺血/再灌注過程中通過產生氧自由基、細胞內鈣超載、線粒體損傷、炎性細胞浸潤等多種機制導致心肌細胞凋亡，故降低細胞凋亡對防治缺血再灌注損傷有重要意義。陳皮素是從蕓香科柑橘屬橘子果皮中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物，川陳皮素含有6個甲氧基，其代謝產物去甲氧化衍生物是主要活性物質，有多種藥理學作用［5-7］，如抗腫瘤、改善記憶、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等藥物性作用。本研究表明川陳皮素可以顯著減少心肌梗死面積和心肌細胞凋亡，從而減輕缺血/再灌注損傷；此作用可能與川陳皮素抑制缺血/再灌注損傷過程中MDA的生成，促進T-SOD的生成，由此減輕氧化應激水平有關。

圖10　川陳皮素對缺血/再灌注　Cleaved-caspase-3的影響及　LY294002的拮抗作用（n=12）

既往研究證實Bcl-2蛋白家族可調控細胞凋亡，其主要包括多種抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，在凋亡途徑中起著重要作用。促凋亡蛋白Bax、Caspase-3被激活后可激活凋亡途徑；而抗凋亡蛋白Bcl-2作用剛好與之相反，可抑制mPTP（線粒體通透性轉換孔）開放，阻斷細胞色素C釋放，抑制半胱天冬酶激活從而抑制細胞凋亡［8-10］。所以，Bcl-2與Bax的比例決定著細胞受凋亡刺激時存活或死亡與否［11］。本研究顯示川陳皮素可以促進Bcl-2的表達，抑制Bax的表達，故Bcl-2與Bax的比例升高，從而抑制細胞凋亡，這是川陳皮素心肌保護作用的另外一個可能的機制。

Akt是重要的細胞存活信號通路，是再灌注損傷存活激酶通路（RISK通路）的重要組成部分。活化的Akt可磷酸化多種凋亡和存活調控分子，包括Bad、Caspase-9、eNOS、CREB、FKHR、GSK-3β等，最終抑制細胞凋亡［12］，在調控細胞存活通路中有著重要的作用。既往研究［11-13］顯示，缺血后處理及藥物后處理可通過激活PI3K-Akt通路減輕心肌缺血再灌注損傷。Zhang et al［2］川陳皮素可通過磷酸化Akt，激活Bcl-2減輕腦細胞凋亡，降低腦缺血損傷；Yasuda et al［3］川陳皮素可引起CREB磷酸化，磷酸化的CREB可引起Bcl-2和BDNF的表達，抑制細胞凋亡。結合本研究結果表明，在小鼠心肌缺血再灌注過程中，磷酸化Akt蛋白表達受抑制，而川陳皮素可上調磷酸化Akt的表達，并抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積。Akt特異性阻斷劑LY294002一定程度上可拮抗川陳皮素后處理所產生的心肌保護作用，表現為Bcl-2與Bax比例降低，caspase-3表達增加，心肌梗死面積和心肌細胞凋亡指數增加。所以Akt信號通路參與了川陳皮素后處理的心肌保護作用。

本研究顯示川陳皮素預處理通過上調Akt和Bcl-2的表達，抑制Bax和caspase-3的表達以及減輕氧化應激反應發揮心肌保護作用，此作用一定程度上可以被PI3K阻斷劑LY294002拮抗，提示Akt是川陳皮素心肌保護作用的重要效應分子。受實驗經費所限，本研究未完善川陳皮素的心肌保護作用是否有濃度梯度效應以及最佳作用劑量，有待后續實驗進一步完善。

［1］Hwang S L，Shih P H，Yen G C.Neuroprotective effects of citrus flavonoids［J］.J Agric Food Chem，2012，60（4）：877-85.

［2］Zhang L，Zhao H，Zhang X，et al.Nobiletin protects against cerebral ischemia via activating the p-Akt，p-CREB，BDNF and Bcl-2 pathway and ameliorating BBB permeability in rat［J］.Brain Res Bull，2013，96：45-53.

［3］Yasuda N，Ishii T，Oyama D，et al.Neuroprotective effect of nobiletin on cerebral ischemia-reperfusion injury in transient middle cerebral artery-occluded rats［J］.Brain Res，2014，1559：46-54.

［4］Hsu C P，Zhai P，Yamamoto T，et al.Silent information regulator 1 protects the heart from ischemia/reperfusion［J］.Circulation，2010，122（21）：2170-82.

［5］Jang S E，Ryu K R，Park S H，et al.Nobiletin and tangeretin a-meliorate scratching behavior in mice by inhibiting the action of histamine and the activation of NF-κB，AP-1 and p38［J］.Int Immunopharmacol，2013，17（3）：502-7.

［6］Nakajima A，Yamakuni T，Haraguchi M，et al.Nobiletin，a citrus flavonoid that improves memory impairment，rescues bulbectomy-induced cholinergic neurodegeneration in mice［J］.J Pharmacol Sci，2007，105（1）：122-6.

［7］Whitman S C，Kurowska E M，Manthey J A，et al.Nobiletin，a citrus flavonoid isolated from tangerines，selectively inhibits class A scavenger receptor-mediated metabolism of acetylated LDL by mouse macrophages［J］.Atherosclerosis，2005，178（1）：25-32.

［8］Kumar D，Jugdutt B I.Apoptosis and oxidants in the heart［J］.J Lab Clin Med，2003，142（5）：288-97.

［9］Green D R，Kroemer G.The pathophysiology of mitochondrial cell death［J］.Science，2004，305（5684）：626-9.

［10］Nishihara M，Miura T，Miki T，et al.Modulation of the mitochondrial permeability transition pore complex in GSK-3beta-mediated myocardial protection［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43（5）：564 -70.

［11］Jacob R，Suzan A，Julia R，et al.Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl-2 family proteins［J］.J Pharmacol Exp Ther，2006，318（1）：186-94.

［12］Hanada M，Feng J，Hemmings B A.Structure，regulation and function of PKB/AKT-a major therapeutic target［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1697（1-2）：3-16.

［13］Zhao Z Q.Postconditioning in reperfusion injury：a status report ［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（3）：265-79.

Nobiletin post-conditioning attenuates myocardial cell apoptosis following myocardial ischemia-reperfusion injury

Chen Cai，Wu Jixiong，Wang Liang，et al
（Dept of Cardiovascular，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the effects of nobiletin post-conditioningon myocardial ischemia-reperfusion injury and the possible mechanisms.Methods Forty-eight healthy male C57BL/6 rats were randomly allocated into sham operation group（Sham group），ischemia/reperfusion injury group（I/R group），nobiletin post-conditioning group（NOB group）and nobiletin post-conditioning group+LY294002 group（NL group）.Myocardial I/R injury was established by occlusion of anterior descending branch of left coronary artery for 30 min followed by 120 min reperfusion.The infarct size and the area at risk were measured by double-staining of Evans Blue and TTC.Myocardial apoptosis was detected by TUNEL.The concertration of MDA was measured by thiobarbituric acid（TBA）and xanthine oxidase was used to measure SOD.Western blot was adopted to detect the expression of the Akt，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and ratio of Bcl-2/Bax.Results Compared with the sham group，the infarct size and apoptosis of I/R group was significantly increased，the expression of Bax and caspase-3 was up-regulated，Akt and Bcl-2 were decreased，and the ratio of Bcl-2/Bax was decreased，the concertration of MDA was significantly increased，but SOD was significantly decreased（P＜0.001）.Compared with the I/R group，the infarct size and apoptosis of NOB group were significantly decreased，the expression of Akt and Bcl-2 was up-regulated，while the expression of Bax and caspase-3 was down-regulated，and the ratio of Bcl-2/Bax was increased，the concertration of MDA was significantly decreased，but SOD was significantly increased（P＜0.001）.Compared with the NOB group，the infarct size and apoptosis of NL group were significantly increased，the expression of Akt and Bcl-2 was down-regulated，while the expression of Bax and caspase-3 was up-regulated，and the ratio of Bcl-2/Bax was decreased，the concertration of MDA was significantly increased，but SOD was significantly decreased（P＜0.001）.Conclusion Nobiletin postconditioning attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury and apoptosis，the mechanism associated with PI3K/ Akt pathway activation reduces oxidative stress.

nobiletin；PI3K/Akt；myocardial ischemia-reperfusion；apoptosis

R 541.4；R 961.1

A

1000-1492（2016）07-0944-07

2016-03-23接收

國家自然科學基金（編號：81202631）

1安徽醫科大學第二附屬醫院心血管內科，合肥 2306012安徽中醫藥大學藥理學教研室，合肥 230032

陳 才，男，碩士研究生；吳繼雄，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：wjx8261@163.com