晚期胃癌含鉑方案化療療效與miR-192表達(dá)水平的研究

劉 威，顧康生，李 敏，寧 潔，張逸寅，黃娜娜

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晚期胃癌含鉑方案化療療效與miR-192表達(dá)水平的研究

劉 威，顧康生，李 敏，寧 潔，張逸寅，黃娜娜

目的 探討晚期胃癌患者癌組織miR-192的表達(dá)水平與一線含鉑化療方案療效的關(guān)系。方法 采用qRT-PCR法檢測(cè)41例晚期胃癌患者癌組織中miR-192的表達(dá)水平，同時(shí)選取相匹配的癌旁組織標(biāo)本20例作為對(duì)照。所有患者接受含鉑方案化療，并評(píng)價(jià)其近期療效。分析胃癌患者癌組織與癌旁組織中miR-192的表達(dá)水平及癌組織中miR-192的表達(dá)水平與臨床病理特征和含鉑化療方案療效的相關(guān)性。結(jié)果 癌組織中miR-192的表達(dá)水平高于癌旁組織（Z=-2.045，P=0.041），癌組織中miR-192的表達(dá)水平與有無(wú)肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（Z=-2.282，P=0.022），而與年齡、性別、ECOG評(píng)分、癌組織分化和飲酒習(xí)慣無(wú)相關(guān)性。41例患者中有39例可評(píng)價(jià)療效，其中1例完全緩解（CR）、7例部分緩解（PR）、18例穩(wěn)定（SD）、13例進(jìn)展（PD），客觀緩解率（ORR）為20.5%，疾病控制率（DCR）為66.7%。miR-192的表達(dá)水平與化療療效呈正相關(guān)（rs=0.156，P=0.035）。結(jié)論 胃癌組織中miR-192的表達(dá)水平與晚期胃癌患者一線含鉑化療方案的近期療效有相關(guān)性。

胃癌；微小RNA；鉑；化療

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.048.html

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期胃癌患者多無(wú)自覺(jué)癥狀，約1/3患者初診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，4%～14%患者轉(zhuǎn)移至肝臟。晚期胃癌無(wú)法行根治性切除，含鉑方案化療是晚期胃癌患者最主要的治療手段。然而，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類存在原發(fā)或繼發(fā)耐藥現(xiàn)象，且鉑類藥物存在許多毒副作用，使接受鉑類化療患者生活質(zhì)量明顯受到影響，急需尋找預(yù)測(cè)鉑類療效的標(biāo)志物。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類單鏈小分子RNA，其異常表達(dá)與腫瘤藥物治療敏感性密切相關(guān)［1］。本課題組前期通過(guò)對(duì)胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901和鉑類耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP中miRNA表達(dá)譜的研究，篩選出miR-192在SGC-7901和SGC-7901/DDP中明顯差異表達(dá)，相關(guān)研究［2］也表明miR-192在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。該研究進(jìn)一步探討晚期胃癌患者癌組織中miR-192表達(dá)水平與含鉑化療方案療效的關(guān)系，為胃癌患者制定個(gè)體化化療方案、為是否選擇鉑類聯(lián)合方案提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2014年12月～2015年6月住院的41例晚期胃癌初治患者，其中男28例，女13例；年齡32～81歲，中位年齡61歲；低差分化25例，中高分化16例；美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）體能評(píng)分：0 ～1分29例，2分12例；有飲酒習(xí)慣者16例，無(wú)飲酒習(xí)慣者25例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃鏡組織病理學(xué)或穿刺細(xì)胞學(xué)確診為晚期胃癌；②既往未接受過(guò)放療、化療；③影像學(xué)檢查證實(shí)有可測(cè)量的腫瘤靶病灶；④ECOG評(píng)分≤2分；⑤無(wú)其它惡性腫瘤病史；⑥患者知情同意下至少接受2個(gè)周期的化療并配合隨訪。病理科借取研究對(duì)象福爾馬林固定石蠟包埋（formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE）組織標(biāo)本及距癌組織2 cm以上癌旁組織標(biāo)本。

1.1.2化療方案 奧沙利鉑100 mg/m2靜滴（第1天）或順鉑20 mg靜滴（第1天至第5天），聯(lián)合口服卡培他濱1 000 mg/m2，每d 2次（第1～14天），或替吉奧膠囊25 mg/m2，每d 2次（第1～14天）。21 d為1周期。

1.1.3療效評(píng)價(jià) 治療2個(gè)周期后按照RECIST1.1版標(biāo)準(zhǔn)［3］評(píng)價(jià)療效，觀察指標(biāo)為完全緩解（cmplete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、穩(wěn)定（stable disease，SD）和進(jìn)展（progressive disease，PD）。本組患者腫瘤靶病灶為影像學(xué)檢查CT或MRI測(cè)量所得最大徑≥10 mm的病灶，同一患者化療前后使用同一種影像學(xué)方法評(píng)估，CT或MRI檢查結(jié)果均由同一檢查者評(píng)估。若研究對(duì)象出現(xiàn)可能為PD的臨床表現(xiàn)可提前評(píng)價(jià)療效，該研究中CR+PR歸為化療有效組，PD歸為化療無(wú)效組，以CR+PR計(jì)算客觀緩解率（objective response rate，ORR），以CR+PR+SD計(jì)算疾病控制率（disease control rate，DCR）。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 miRNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（real time quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自江蘇南通Biomics公司；miR-192及內(nèi)參 U6特異性檢測(cè)引物由江蘇南通Biomics公司設(shè)計(jì)合成；Mx3000P qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1FFPE組織中miRNA的提取 按試劑盒說(shuō)明書操作，步驟簡(jiǎn)述如下：①切取3片10 μm厚組織置于2 ml無(wú)RNA酶的EP管中，加入1 ml二甲苯，劇烈振蕩10 s，室溫下16 000 r/min離心2 min，棄上清液；②加1 ml 100%乙醇溶液，劇烈混勻后，室溫16 000 r/min離心2 min，棄上清液；③風(fēng)干后加入150 μl PKD緩沖液及10 μl蛋白酶K，振蕩混勻，56℃孵育15 min，然后80℃孵育15 min；④冰上孵育3 min，20 000 r/min離心15 min后轉(zhuǎn)移上清液置于新的EP管中；⑤加入16 μl DNA酶增強(qiáng)液及10 μl DNA酶Ⅰ，混勻后室溫孵育15 min；⑥ 加入320 μl RBC緩沖液及1 120 μl 100%乙醇溶液，混勻后取680 μl置于過(guò)濾柱中，10 000 r/min離心20 s，棄濾液，重復(fù)上述過(guò)程至全部樣本通過(guò)過(guò)濾柱；⑦加500 μl RPE緩沖液，10 000 r/min離心20 s，棄濾液，重復(fù)上述步驟1次；⑧將miRNeasy MinElute離心管置于新的收集管中，14 000 r/min離心5 min，棄濾液；⑨ 將miRNeasy MinElute離心管置于新的RNA收集管中，加30 μl無(wú)RNA酶水，14 000 r/min離心1 min，使用NanoDropTM1000 spectrophotometer測(cè)定總RNA純度，用光密度（optical density，OD）表示，OD260/OD280的比值在1.8～2.1，將提取的RNA置于-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?.2.2 逆轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR檢測(cè) 參照EzOmicsTMOne-Step qPCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行 qRT-PCR，以 U6為內(nèi)參，加入3 μl總RNA提取液，再加 miR-192、U6特異性逆轉(zhuǎn)錄引物、上游及下游引物、2×Master Mix配置成25μl反應(yīng)體系，不足部分用無(wú)RNase的DEPC-H2O補(bǔ)齊。將準(zhǔn)備好反應(yīng)物的PCR 8聯(lián)管放入Mx3000P qRT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：42℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，并在72℃收集熒光信號(hào)。ΔCt=CtmiR-192-CtU6，2-ΔCt表示晚期胃癌患者FFPE組織中miR-192相對(duì)表達(dá)量［4］。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。對(duì)Mx3000P qRT-PCR檢測(cè)軟件導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗(yàn)，通過(guò)受試者工作特征曲線（rece-iver operator characteristic curve，ROC）判斷miR-192表達(dá)水平對(duì)晚期胃癌一線含鉑方案化療療效的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2　結(jié)果

2.1晚期胃癌患者癌及癌旁組織中miR-192的表達(dá) 胃癌患者癌與癌旁組織中miR-192相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)和四分位數(shù)間距分別為0.055和0.038、0.105和0.051，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.118和0.053、0.127和0.054，胃癌患者癌組織miR-192相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（Z=-2.045，P=0.041）。見(jiàn)圖1。

圖1　miR-192在胃癌癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.2晚期胃癌患者化療有效組及無(wú)效組miR-192的表達(dá) 39例可評(píng)價(jià)療效的胃癌患者中化療有效組8例，無(wú)效組13例，miR-192相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)和四分位數(shù)間距分別為0.089和0.022、0.214和0.409，平均值和標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.238和0.135、0.406和0.143，化療有效組miR-192相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)效組（Z=-2.287，P=0.010）。見(jiàn)圖2。

2.3晚期胃癌患者癌組織中miR-192 PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖3A，PCR產(chǎn)物溶解曲線見(jiàn)圖3B，癌組織中提取的miR-192無(wú)非特異性擴(kuò)增，有良好的擴(kuò)增效率。

表1　胃癌患者癌組織中miR-192表達(dá)變化與臨床病理特征的關(guān)系

圖2　胃癌患者含鉑化療有效組和無(wú)效組miR-192的相對(duì)表達(dá)量

圖3　miR-192 PCR反應(yīng)

2.4晚期胃癌患者癌組織中miR-192的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 晚期胃癌患者癌組織中miR-192的表達(dá)水平與有無(wú)肝轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、ECOG評(píng)分、癌組織分化和飲酒習(xí)慣無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表1。

2.5晚期胃癌患者癌組織中miR-192的表達(dá)與含鉑化療方案療效的關(guān)系 41例患者中有2例失訪，其余39例可評(píng)價(jià)療效，其中1例CR、7例PR、18例SD、13例PD，ORR為20.5%，DCR為66.7%，miR-192的相對(duì)表達(dá)量與化療療效呈正相關(guān)性（Spearman秩相關(guān)系數(shù)rs=0.156，P=0.035）。進(jìn)一步采用ROC曲線判斷miR-192表達(dá)水平預(yù)測(cè)化療后疾病控制的最佳截?cái)嘀担€下面積（area under the ROC curve，AUC）為 0.711，95% 置信區(qū)間：0.542～0.880，取約登指數(shù)的最大值為0.497時(shí)，miR-192的相對(duì)表達(dá)量為0.027，預(yù)測(cè)含鉑方案化療后疾病控制的靈敏度為0.857，特異度為0.640。見(jiàn)圖4。

圖4　miR-192表達(dá)水平預(yù)測(cè)胃癌患者含鉑方案化療近期療效的ROC曲線

3　討論

胃癌是一種高發(fā)病率的惡性腫瘤，根據(jù)2015年《腫瘤登記年報(bào)》數(shù)據(jù)，中國(guó)胃癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第二位，死亡率居第三位［5］。晚期胃癌患者預(yù)后差，5年生存率＜10%，因此，化療成為晚期患者改善預(yù)后的重要方法。目前，鉑類化療藥物，特別是草酸鉑和順鉑，是晚期胃癌治療的基石。然而，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)鉑類化療藥物存在原發(fā)或繼發(fā)耐藥，使得臨床應(yīng)用時(shí)僅部分患者對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的化療方案敏感，且鉑類有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因而尋找預(yù)測(cè)鉑類化療療效的敏感性標(biāo)志物成為實(shí)現(xiàn)胃癌個(gè)體化治療的關(guān)注點(diǎn)。

miRNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，其通過(guò)與靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)域互補(bǔ)匹配，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)目的基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致靶mRNA分子降解或翻譯受到抑制［6-7］。miRNA是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，其異常表達(dá)與腫瘤化療敏感性密切相關(guān)，可能會(huì)成為對(duì)腫瘤化療療效有潛在預(yù)測(cè)作用的新型標(biāo)志物。張芳等［8］應(yīng)用qRT-PCR及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法表明miR-192在轉(zhuǎn)錄后水平靶向負(fù)調(diào)控促凋亡基因Bim的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞順鉑耐藥。Odenthal et al［9］研究結(jié)果表明miR-192的表達(dá)與新輔助化療療效相關(guān)，化療后有效患者miR-192表達(dá)顯著下調(diào)。miRNA的異常表達(dá)與卵巢癌含鉑方案化療敏感性密切相關(guān)［10］。我們前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示miR-192在SGC-7901和SGC-7901/DDP中明顯差異表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-192通過(guò)靶向調(diào)控核苷酸切除修復(fù)途徑中ERCC3和ERCC4的表達(dá)，增加胃癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞順鉑耐藥。然而，在晚期胃癌患者組織中miR-192的表達(dá)與含鉑方案化療敏感性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，故本研究進(jìn)一步探討胃癌患者癌組織中miR-192的表達(dá)與含鉑方案化療有無(wú)相關(guān)性。

本研究通過(guò)qRT-PCR法分析了晚期初治胃癌患者癌組織與相匹配癌旁組織中miR-192的表達(dá)，顯示其在癌組織表達(dá)上調(diào)，與研究［2，11］結(jié)果一致。肝轉(zhuǎn)移患者miR-192表達(dá)水平較無(wú)轉(zhuǎn)移者升高，與研究［12］結(jié)論相符，提示miR-192可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中充當(dāng)癌基因的作用。為進(jìn)一步探討miR-192在晚期胃癌患者一線含鉑方案化療療效預(yù)測(cè)中的可能作用，本研究觀察了癌組織中miR-192的表達(dá)與化療療效的關(guān)系，顯示含鉑方案化療有效組miR-192的表達(dá)量顯著高于無(wú)效組，miR-192的表達(dá)水平與一線含鉑化療療效呈正相關(guān)性，這與前期研究SGC7901/DDP相對(duì)于SGC7901 miR-192的表達(dá)水平下調(diào)相符合。與此同時(shí)，本研究進(jìn)一步分析了miR-192表達(dá)水平預(yù)測(cè)晚期胃癌患者一線含鉑方案化療后疾病控制的最佳截?cái)嘀担砻鱩iR-192相對(duì)表達(dá)量大于0.027時(shí)，接受含鉑方案化療可能獲得化療后疾病控制。但本實(shí)驗(yàn)獲得的ROC曲線的AUC值為0.711，且約登指數(shù)較小，預(yù)測(cè)胃癌患者化療療效的檢驗(yàn)效能一般，有待于進(jìn)一步增加樣本量提高效能。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處：①樣本量較少，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偏倚；②由于晚期胃癌患者胃鏡取材量不足或取材不當(dāng)，造成檢測(cè)結(jié)果陰性。

綜上所述，晚期胃癌患者癌組織較癌旁組織中miR-192表達(dá)水平上調(diào)，miR-192的表達(dá)水平與晚期胃癌患者一線含鉑方案化療的近期療效相關(guān)。但由于隨訪時(shí)間短和樣本量有限，尚未進(jìn)行晚期胃癌患者的遠(yuǎn)期生存分析，相關(guān)研究結(jié)果尚需要大樣本前瞻隨機(jī)性對(duì)照研究加以驗(yàn)證，以期早日應(yīng)用于腫瘤患者的個(gè)體化治療。

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On the correlation between miR-192 expression and the efficacy of platinum-based chemotherapy in patients with advanced gastric carcinoma

Liu Wei，Gu Kangsheng，Li Min，et al
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To investigate the correlation between miR-192 expression in the tumor tissues and the efficacy of first-line platinum-based chemotherapy in the patients of advanced gastric carcinoma.Methods The miR-192 expression was measured by real-time quantitative PCR in the tumor tissues from 41 patients with advanced gastric carcinoma and in the adjacent non-tumorous normal tissues from 20 patients.All the enrolled patients were received platinum-based chemotherapy and the chemotherapeutic efficacy was evaluated.miR-192 expression level in tumorous and non-tumorous component and its correlation with clinicopathological characteristics and platinumbased chemotherapy efficacy were evaluated.Results The miR-192 expression was higher inside the tumor tissues than adjacent non-tumorous normal tissues（Z=-2.045，P=0.041）and its level in carcinomatous component was statistically correlated with the presence of liver metastasis（Z=-2.282，P=0.022），while independent of age，sex，ECOG score，tumor grade and drinking behavior.Thirty-nine patients were considered evaluable for efficacy.There were CR in 1 case，PR in 7 cases，SD in 18 cases，and PD in 13 cases.ORR was 20.5%and DCR was 66.7%.miR-192 expression level was positively correlated with chemotherapy efficacy（rs=0.156，P= 0.035）.Conclusion miR-192 expression in the tumor tissues is correlated with the short-term chemotherapeutic efficacy of patients with advanced gastric carcinoma treated with platinum-based chemotherapy.

gastric carcinoma；microRNA；platinum；chemotherapy

Q 522；R 735.2

A

1000-1492（2016）07-1027-05

2016-03-23接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085MH203）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 230022

劉 威，男，碩士研究生；顧康生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：13805692145@163.com