一種潰瘍性結腸炎相關性結腸癌小鼠模型的建立

張　瑞， 朱　娜， 馬　靜， 張文平， 劉近春， 原麗莉*

(1山西醫學科學院，山西醫科大學附屬山西大醫院消化內科，太原　030032； 2山西醫科大學第二臨床醫學院； 3山西醫科大學第一臨床醫學院； 4山西醫科大學公共衛生學院； *通訊作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)

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一種潰瘍性結腸炎相關性結腸癌小鼠模型的建立

張瑞1,2， 朱娜1， 馬靜3， 張文平4， 劉近春3， 原麗莉1*

(1山西醫學科學院，山西醫科大學附屬山西大醫院消化內科，太原030032；2山西醫科大學第二臨床醫學院；3山西醫科大學第一臨床醫學院；4山西醫科大學公共衛生學院；*通訊作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)

目的建立一種簡單易行的潰瘍性結腸炎相關的結腸癌小鼠模型。方法5周齡C57BL/6J雄性小鼠被分為實驗組(n=10)和對照組(n=7)。實驗組小鼠腹腔注射致癌劑氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg后給于致炎劑2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)飲水4 d，之后換為普通飲水17 d為1個周期，共3個周期結束；對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。解剖鏡大體觀察結腸，并對結腸進行炎癥評分、黏膜息肉評分和腫瘤病理評分，評分結果采用非配對t檢驗，檢驗水準取ɑ=0.05。結果實驗組小鼠腹腔注射AOM后無明顯變化，給予DSS后有50%小鼠出現血便，且逐漸加重，試驗結束時小鼠表現為反應遲鈍，活動減少，出現血便的小鼠均有脫肛。對照組小鼠無異常表現。實驗組小鼠較對照組體重增長明顯減緩。試驗結束時，所有實驗組小鼠遠端及中段大腸出現不典型增生/癌變，大體解剖鏡炎癥評分、息肉評分和病理切片腫瘤評分均顯著高于對照組(P<0.05)。結論致癌劑AOM和致炎劑DSS可誘導小鼠建立潰瘍性結腸炎相關的結腸癌模型。

潰瘍性結腸炎相關性結腸癌；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸鈉；動物模型

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，好發于直腸與乙狀結腸交界處，發病率占胃腸道腫瘤的第3位，近年來呈現出上升趨勢。結腸癌的發病與遺傳、環境等因素有關，炎癥性腸病患者、結腸息肉患者、有膽囊切除史的患者、男性肥胖者等為易感人群。炎癥性腸病，如潰瘍性結腸炎和克羅恩病是腸道的慢性炎癥狀態，常常伴隨結腸癌發病率的增加。潰瘍性結腸炎患者的結腸癌發生率是正常人群的5.7倍，且發病年齡提前[1]。隨著我國飲食結構的改變，高熱量、高蛋白、低纖維的食物攝入增多，食物中潛在的化學致癌劑容易誘發結腸腫瘤的發生。動物實驗和流行病學實驗研究表明，結腸癌的發生、發展與結腸的炎癥程度、炎癥范圍及病程長短有密切關系，反復的炎癥發作是惡性腫瘤形成的重要原因之一，但是其中的分子生物學，免疫病理學及遺傳學等機制卻不明確[2，3]，因而，探討結腸炎發展為結腸癌的病理機制將有助于相關疾病的預防及治療。由炎癥向腫瘤發生、發展過程是研究腫瘤發病機制，因此建立炎癥基礎上的腫瘤模型對于研究這一過程非常重要。許多研究表明，腸道的慢性反復性炎癥發作如潰瘍性結腸炎會明顯地增加結腸癌的發生率, 而建立結腸炎相關結腸癌動物模型是對于其中的機制研究及治療方法探索的基礎。本研究在小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)基礎上，再給予飲用濃度為2%的葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)飲用水來建立潰瘍性結腸炎相關結腸癌動物模型。

1　材料和方法

1.1小鼠及主要試劑

5周齡C57BL/6J雄性小鼠，體質量15-20 g,購于北京海斯萊克實驗動物中心。小鼠飼養于山西醫科大學公共衛生學院毒理學實驗動物中心，自由飲水、飼以普通顆粒飼料。氧化偶氮甲烷(AOM)購于美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS)，分子量36 000-50 000，購于MP Biomedical公司。

1.2小鼠潰瘍性結腸炎相關結腸癌模型的制作

5周齡C57BL/6J雄性小鼠17只被隨機分實驗組(10只)和對照組(7只)。參照文獻[3]的方法，實驗組小鼠先以AOM 10 mg/kg體重腹腔注射1次，1周后以2% DSS飲用水飲用4 d，之后以普通飲用水連續飲用17 d為1個周期；重復3個周期；對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，后普通飲食喂養。

1.3小鼠潰瘍性結腸炎相關結腸癌模型臨床表現觀察

試驗期間，每天觀察動物健康狀況，包括毛色、活動、糞便性狀，有無肉眼血便及脫肛等情況，每周測量小鼠體重1次。實驗期間不禁食。

1.4小鼠潰瘍性結腸炎相關結腸癌模型的指標評價

試驗結束后，乙醚麻醉處死小鼠，分離肛門至回盲部連接處整段大腸。沿腸縱軸切開大腸，生理鹽水沖洗，測量大腸的長度。解剖鏡大體觀察，按照文獻[4]的方法對結腸進行炎癥評分和黏膜息肉評分[4]。

結腸炎癥評分標準如下：當臨床癥狀及結腸出現以下每一項時各記1分，如充血、出血、狹窄、潰瘍、血便、黏液、腹瀉和粘連，加上結腸距肛門1 cm處或結腸病變部位最厚處的厚度(mm)得分。

結腸息肉評分系統是根據觀察到結腸的息肉數目來進行評價：無息肉為0分，1-3個孤立息肉為1分，4個或以上孤立息肉為2分，幾個息肉融合成片或隆起呈塊狀為3分。之后給予10 %中性甲醛對結腸進行固定，經包埋、切片、HE染色，按照文獻[4]的方法進行顯微鏡下腫瘤病理評分。

腫瘤評分標準基于以下3個方面：隱窩(正常為0分，杯狀細胞減少為1分；分支狀、不規則、隱窩腔擴張為2分；萌芽復合體為3分)；上皮(正常為0分，過度增生或畸形隱窩病灶為1分，輕度不典型增生：核仁增大、輕度深染、細胞核秘籍分層現象為2分，高度不典型增生：細胞核分層、重度深染、多形性、核極性消失為3分)，黏膜下浸潤(無為0分，有為1分)。動物尸體由山西醫科大學實驗動物研究中心統一處理。

1.5統計學分析

所以數據經SPSS13.0軟件包進行分析，結果以均數±標準差的形式表示。采用非配對t檢驗，檢驗水準取ɑ=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1小鼠結腸癌發展過程中臨床表現觀察

小鼠皮下注射AOM后其攝食量無明顯變化，自主活動如常，排便正常，體重無減輕。隨后給予DSS，小鼠的攝食量呈現逐漸下降趨勢，活動也逐漸減少。在第1個試驗周期，實驗組小鼠在給予DSS后的第2天有2例出現稀便，第3天有3例小鼠出現血便，第4天增加到5例。2例小鼠有黏液便，血便最長維持5 d后緩解，正常飲水后逐漸恢復。在第2個試驗周期，給予DSS后第3天實驗組小鼠即有8例出現血便，正常飲水后漸恢復。在第3個試驗周期，給予DSS后第1天實驗組小鼠即出現血便，第3天所有小鼠均出現血便或黏液血便，最長持續7 d，改自來水后逐漸緩解。在整個實驗結束時，出現血便的小鼠均出現脫肛現象。此時所有的小鼠均反應遲鈍，活動減少，動作緩慢不靈。對照組小鼠無異常表現。

2.2小鼠結腸癌發展過程中飲食及體質量的變化

給予AOM后，實驗組小鼠的進食、飲水量與對照組小鼠無明顯差異。而給予DSS后，實驗組小鼠的進食、飲水均減少。換用正常飲水后，小鼠進食、飲水逐漸恢復。在第1周期和第3周期飲用DSS期間，實驗組小鼠體重增加低于對照組，且差異有統計學意義(P=0.001 3和P=0.013)； 在第2周期，兩組小鼠體質量增加雖無統計學差異(P>0.05)，但實驗組小鼠仍低于對照組。實驗結束時，實驗組小鼠體質量平均增加程度顯著低于對照組(P=0.004)。

表1不同處理后小鼠體質量變化(g)

Table 1Changes of body weight of mice before and after treatment(g)

分組n體質量增加(g)第1周期第2周期第3周期整個實驗前后實驗組100.12±0.360.14±0.28-1.32±0.393.8±0.92對照組72.40±0.500.23±0.13 2.20±1.398.1±0.79 t3.930.2472.2833.386 P0.00130.8080.01260.0041

2.3小鼠潰瘍性結腸炎相關性結腸癌的病理改變

實驗結束時，實驗組小鼠的大腸與周圍組織粘連加重，腸壁有不同程度的充血、水腫，腸道皺褶減少或消失，腸道質地變硬。實驗組小鼠大腸均可見一處或多處直徑5-11 mm息肉樣圓形隆起，大多數位于結腸遠端，其次為結腸中段，結腸近口側沒有腫瘤形成(見圖1)。實驗結束時的大體解剖鏡炎癥評分及息肉評分結果顯示，實驗組炎癥評分指數、息肉評分指數和顯微鏡下腫瘤評分指數均顯著高于正常對照組，且有統計學差異(P<0.05)。病理HE切片，可見對照組腺體結構正常，沒有杯狀細胞減少，高倍鏡上皮正常，無不典型增生(見圖2A、B)；實驗組腺體排列紊亂，杯狀細胞減少，隱窩腔擴張，分支狀畸形，上皮過度增生，高倍鏡下核仁增大，

細胞核分層，重度深染，多形性，有黏膜下浸潤(見圖2C、D)。所有實驗組小鼠腸道有不同程度的炎癥表現：滲出、白細胞浸潤、黏膜潰瘍或壞死等。實驗組有5例(50%)小鼠發展成結腸癌，表現為高度不典型增生或早期浸潤癌等。有脫肛的小鼠，大腸息肉樣隆起數量多，發生部位多，容易融合成大的腫瘤(見圖1)，病理切片表現較嚴重，呈白細胞滲出、浸潤、黏膜潰瘍或壞死、腺體不典型增生及浸潤癌等(見圖2)。

表2小鼠大腸炎癥評分、息肉評分及腫瘤病理評分

Table 2Inflammation score, polyp score and tumor pathological score in colon of mice

分組n大體解剖鏡評分炎癥評分息肉評分顯微鏡下腫瘤評分試驗組105.52±0.941.50±0.27 5.10±0.41 對照組70.71±0.020.14±0.141.13±0.30t4.8424.4827.538P0.00020.0002<0.0001

圖1　小鼠結腸大體表現及脫肛現象Figure 1　Gross appearance of colon and prolapse phenomenon of mice

A.對照組×40倍　　　　　B.對照組×400倍　　　　　C.實驗組×40倍　　　　　D.實驗組×400倍圖2　不同處理小鼠大腸病理HE染色顯微鏡下表現Figure 2　Pathology of colon in mice after different treatment under microscope after HE staining

3　討論

目前已經建立了多種結腸炎相關結腸癌模型，如用IL-10基因敲除小鼠制作的結腸癌模型[7]，是一類以結腸炎癥相關遺傳缺陷為基礎的動物結腸癌模型，此種小鼠通常在完全無菌的環境中生長，當在有螺桿菌的環境中飼養時就會逐漸出現潰瘍性結腸炎甚至發展到結腸癌。IL-2或Muc2等基因敲除也能造出炎癥性腸病相關結腸癌動物模型[8]。通過移植腫瘤細胞株的方法也可以制作結腸癌模型，但是難以觀察到由炎癥向腫瘤轉化的過程。更常用的是化學誘導的方法制作的動物模型，如飲水中加入DSS,可在動物身上復制結腸炎相關臨床癥狀、體征及病理學改變，這些表現與人類潰瘍性結腸炎相類似，但是單獨使用DSS時結腸癌模型成功的比例較低，單獨使用化學試劑比如1,2-二甲肼或氧化偶氮甲烷時成癌率不高，且耗時較長[9]。一些研究報道采用結合飲用DSS水加上注射DMH或AOM制造潰瘍性結腸炎相關小鼠結腸癌模型，可以很好地解決了上述存在的問題[10,11]。

本研究聯合使用AOM和DSS處理小鼠制造潰瘍性結腸炎相關結腸癌動物模型。AOM是一種結腸癌致癌劑，它通過細胞膜和DNA的過氧化，引起結腸黏膜細胞的過度增殖。AOM能在嚙齒動物大腸內誘導出體征、病理變化方面和人類結腸癌相似，是一種結腸基因毒性的致癌劑，被廣泛應用于研究嚙齒動物結腸癌發病機制等[12]。DSS是由蔗糖合成的一種硫酸多糖體，通過其細胞毒性作用干擾腸道淋巴細胞和上皮細胞之間的關系，激活腸道的免疫系統，刺激腸道上皮細胞產生細胞因子，增加中性粒細胞的集聚，造成潰瘍性結腸炎的形成，其臨床特點與人類潰瘍性結腸炎非常相近，是一種非基因毒性的結腸致癌劑，在嚙齒動物中被廣泛應用于制作潰瘍性結腸炎模型，它是一種能刺激結腸癌變的炎癥誘導劑[13,14]。

本實驗結果顯示，聯合使用AOM和DSS建立的小鼠潰瘍性結腸炎相關性大腸癌模型，與人類潰瘍性結腸炎相關性大腸癌在臨床體征及病理變化方面相似，較好地模擬了人類潰瘍性結腸炎相關性大腸癌的發生發展過程，可被用于結腸癌發生、發展機制的研究。

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Establishment of a mouse model of ulcerative colitis-associated colorectal cancer

ZHANG Rui1,2, ZHU Na1, MA Jing3, ZHANG Wenping4, LIU Jinchun3, YUAN Lili1*

(1DepartmentofGastroenterology,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030032,China;2SecondClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;3FirstClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;4SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Dangyuan831@sina.com)

ObjectiveTo establish a colitis-associated colorectal cancer mouse model.MethodsThe 5-week-old C57BL/6J male mice were randomized into experiment group(n=10) and control group(n=7). The mice in experiment group were intraperitoneally injected with azoxymethane(AOM,10 mg/kg body weight), and then given the water including 2% DSS for 4 d and finally regular water for 17 d. The process repeated 3 times. The mice in control group were given only regular water. The colon was observed under dissecting microscope, and colon inflammation score, mucosal polyp score and pathological score were evaluated and analyzed with the unpairedttest(ɑ= 0.05).ResultsNo obvious changes happened in only AMO-treated mice, but after giving DSS, half of the mice showed the bloody stools and gradually got worse. At the end of experiment, the mice in expriment group showed less activity, and all the mice with bloody stools showed rectal prolapse. The mice in control group had no change. The mice in experiment group showed less weight gain than in control group. At the end of the experiment, all mice showed dysplasia/cancer in middle distal colon in experiment group, and gross anatomy mirror inflammation score, polyp score and pathological tumor rates were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionAOM followed by DSS can effectively induce the formation of colitis-induced colorectal cancer in mice.

ulcerative colitis-associated colorectal cancer;azoxymethane;dextran sodium sulfate;animal model

山西省留學人員管理委員會科研基金資助項目(晉留辦發2010-14-97)

張瑞，男，1969-11生，碩士，副主任醫師,E-mail：zhangruim@hotmail.com

2016-05-06

R735.35

A

1007-6611(2016)08-0720-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.010