異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護作用及機制

楊雅婷，王媛，徐瑩，潘峰，趙平（中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004）

異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的腦保護作用及機制

楊雅婷，王媛，徐瑩，潘峰，趙平
（中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽110004）

目的 探討異氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷大鼠的保護作用及機制。方法 選取7日齡新生SD大鼠100只，隨機分為假手術組（Sham組）、缺血缺氧組（HI組）、1.5%異氟醚后處理組（Iso組）、1.5%異氟醚后處理+激動劑組（Iso+AMPA組）、1.5%異氟醚后處理+抑制劑組（Iso+CNQX組），每組20只。除Sham組大鼠僅找到左側頸總動脈不結扎，其余各組大鼠均雙重結扎左側頸總動脈，后放回母鼠身邊喂哺2 h，再以8%O2+92%N2的濕化混合氣體以2 L/min流量低氧處理2 h，制備HIBD模型。模型制備成功后，Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組均即刻吸入1.5%異氟醚30 min，以30%O2+70%N2濕化混合氣體輸送，流量2 L/min，其余各組僅吸入30%O2+70%N2濕化混合氣體，流量2 L/min處理30 min。大鼠蘇醒后，30 min內完成側腦室注射：Sham組、HI組、Iso組左側腦室注射生理鹽水5 μL，Iso+AMPA組左側腦室注射AMPA 5 μL，濃度為50 μg/mL，Iso+CNQX組左側腦室注射CNQX 5 μL，濃度為50 μg/mL。手術后7 d，測定大鼠體質量，測定左/右大腦半球質量并計算質量比，切片HE染色計數左、右側大腦海馬CA1區正常神經元并計算密度比。結果 各組大鼠體質量比較無統計學差異（P均＞0.05），與Sham組比較，各組大鼠左/右大腦半球質量比均下降（P均＜0.05），左/右側海馬CA1區正常神經元密度比下降（P均＜0.05），與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組大鼠左/右大腦半球質量比及左/右側海馬CA1區正常神經元密度比明顯升高（P均＜0.05），而Iso+AMPA組大鼠左/右大腦半球質量比及左/右側海馬CA1區正常神經元密度比卻無明顯變化（P均＞0.05）。相較Iso組，Iso+CNQX組大鼠左/右大腦半球質量比及左/右側海馬CA1區正常神經元密度比無明顯變化（P均＞0.05），而Iso+AMPA組大鼠左/右大腦半球質量比及左/右側海馬CA1區正常神經元密度比明顯降低（P均＜0.05）。結論 異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有保護作用，其機制可能與抑制AMPA受體過度活化有關。

顱腦損傷；缺血缺氧；異氟醚；異氟醚后處理；新生大鼠；AMPA受體

新生兒缺血缺氧性腦損傷（HIBD）是圍產期因某種因素引起的新生兒窒息導致的腦損傷，致死率高達25%，幸存患兒致殘率高達25%，目前臨床尚無有效的治療方法［1，2］。HIBD的發病機制復雜，涉及神經毒性學說、能量代謝學說、氧化應激學說、免疫炎癥學說等方面。其中，神經毒性學說在諸如缺血缺氧性腦病、癲癇、阿爾茨海默病、帕金森等各種中樞神經系疾病的發生發展中占重要地位，因此中樞神經系統中最重要的興奮性神經遞質谷氨酸及其受體成為相關領域的研究熱點。本課題組前期研究證實異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有保護作用，且該保護作用可能與抑制線粒體通透性轉換孔（mPTP）的開放有關。mPTP開放可導致能量合成及細胞氧化反應障礙，引發級聯反應，導致ATP水平下降，而細胞內Ca2+濃度的升高與ATP水平密切相關［3～5］。AMPA受體作為谷氨酸受體的重要離子亞型，大量研究表明谷氨酸與受體結合后，AMPA受體激活先于NMDA受體，其受體數量和類型的改變對Ca2+通透性起關鍵作用［6］，國內有研究證明在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型中應用AMPA受體阻斷劑可減輕新生大鼠的腦損傷程度［7］，丙泊酚后處理在成年大鼠缺血再灌注損傷模型中對AMPA受體亞型亦有影響［8］，而有關異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護作用是否與AMPA受體有關尚未見相關報道。2014年6～12月，我們通過構建新生大鼠缺血缺氧性腦損傷模型，觀察AMPA受體拮抗劑和激動劑對異氟醚后處理腦保護作用的影響，進一步探討異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 7日齡新生SD大鼠100只，體質量12～16 g，雌鼠與雄鼠由中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心提供，購自遼寧長生生物技術有限公司，雌鼠體質量200～250 g，雄鼠250～350 g，動物飼養在SPF級，孕鼠分籠飼養。異氟醚（活寧）購自上海雅培制藥有限公司；AMPA由英國Abcam公司分裝進口；CNQX由英國Abcam公司分裝進口；7-0絲線購自中國杭州愛普醫療器械有限公司；4%多聚甲醛固定液購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗中心；蔗糖：國產分析純；伊紅染色液、蘇木素染色液購自上海百蕊生物科技有限公司；氣體監護儀購自美國Datex-Ohmeda公司；電熱恒溫水浴箱購自上海躍進醫療器械廠；FA1004天平購自上海天平儀器廠；光學顯微鏡購自Olympus公司。

1.2 模型制備及分組 將大鼠隨機分為5組，即假手術組（Sham組）、缺血缺氧組（HI組）、1.5%異氟醚后處理組（Iso組）、1.5%異氟醚后處理+激動劑組（Iso+AMPA組）、1.5%異氟醚后處理+抑制劑組（Iso+CNQX組）。參考文獻［9，10］方法制備HIBD模型。新生大鼠異氟醚麻醉，將其固定于消毒手術板上，并用面罩持續吸入異氟醚維持麻醉，于解剖顯微鏡下用7-0絲線兩次結扎左側頸總動脈，縫合傷口于母鼠身邊喂哺2 h。自制缺氧箱置于水浴箱內，維持水浴溫度37℃，缺氧箱底鋪鈉石灰以吸收CO2和水蒸氣，將大鼠置于鈉石灰上的軟墊上。氣體監護儀監測，以2 L/min的流量持續濕化輸入8%O2+92%N2的混合氣體，低氧處理2 h后取出。Sham組只暴露頸總動脈但不結扎，不進行低氧處理，其余各組均進行缺血缺氧處理。之后Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組即刻吸入由30%O2+70%N2濕化混合氣體以2 L/min輸送的1.5%異氟醚30 min，Sham組、HI組同樣環境只吸入30%O2+70%N2濕化混合氣體2 L/min，30 min。異氟醚處理后30 min內完成側腦室注射：參考文獻［11］的方法，Iso+AMPA組左側腦室注射AMPA 5 μL（50 μg/mL），參考文獻［12］的方法，Iso+CNQX組左側腦室注射CNQX 5 μL（50 μg/mL），其余各組左側腦室注射生理鹽水5 μL。

1.3 新生大鼠存活情況及體質量監測 缺血缺氧后，記錄1周內各組新生大鼠存活只數及體質量變化，對比術后7 d與大鼠缺氧前的體質量改變。

1.4 左/右大腦半球質量比測算 缺血缺氧后7 d，新生大鼠于深麻醉狀態下，暴露心臟剪破左心室放血，迅速斷頭取腦，冰上用冷鹽水沖洗，腦組織表面血跡干凈后用濾紙吸干多余的水分，分離左右大腦半球各自稱重，計算左/右大腦半球質量比。

1.5 左/右側海馬CA1區正常神經元密度比測算缺血缺氧后7 d，新生大鼠于深麻醉狀態下心臟灌流生理鹽水30 mL，之后灌注4%多聚甲醛30 mL內固定，迅速斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中，室溫固定8 h，再分別用20%、30%蔗糖溶液行梯度脫水。取大腦中后1/3，行冰凍冠狀切片，片厚8 μm。室溫晾干6 h后行HE染色，中性樹膠封片、晾干。檢測海馬CA1區神經元密度：光學顯微鏡下400倍照相，于左右對應海馬CA1區選取三個視野，0.002 5 mm2范圍計數正常細胞數并取平均值，計算左/右正常神經元密度比。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用單因素方差分析，樣本均數兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠存活情況及體質量比較 各組大鼠死亡主要發生在缺血缺氧過程中，結果顯示僅HI組、Iso組、Iso+AMPA組各死亡1只，Sham組、Iso+ CNQX組無死亡。各組大鼠體質量統計顯示，缺血缺氧前與缺血缺氧后7 d比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表1。

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質量比較（g±s）

表1 各組新生大鼠缺血缺氧前和缺血缺氧后7 d體質量比較（g±s）

組別n 7 d體質量缺血缺氧前缺血缺氧后Sham組2014.18±0.2128.62±0.37 HI組1914.32±0.3528.95±0.30 Iso組1914.35±0.3228.70±0.47 Iso+AMPA組1914.40±0.4028.43±0.34 Iso+CNQX組2014.46±0.2628.66±0.37

2.2 左/右大腦半球質量比比較 與Sham組比較，各組大鼠左/右大腦半球質量比均顯著降低（P＜0.05）；與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組左/右大腦半球質量比顯著升高（P均＜0.05），而Iso+AMPA組無明顯改變（P＞0.05）；與Iso組比較，Iso+CNQX組左/右大腦半球質量比無明顯變化（P＞0.05），Iso+AMPA組左/右大腦半球質量明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠左/右大腦半球質量及比值比較±s）

表2 各組大鼠左/右大腦半球質量及比值比較±s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與HI組比較，△P＜0.05；與Iso組比較，○P＜0.05。

組別n左大腦半球質量（g）左右大腦半球質量比右大腦半球質量（g）Sham組100.500±0.0140.492±0.0151.015±0.033 HI組90.370±0.036*0.498±0.0130.742±0.070*Iso組90.451±0.020*△0.494±0.0110.913±0.049*△Iso+AMPA組90.382±0.018*○0.490±0.0090.779±0.039*○Iso+CNQX組100.459±0.017*△0.496±0.0140.927±0.033*△

2.3 左/右側海馬CA1區正常神經元密度比比較

Sham組、HI組、Iso組、Iso+AMPA組、Iso+CNQX組左/右側海馬CA1區正常神經元密度比分別為0.970±0.021、0.599±0.020、0.759±0.021、0.594 ±0.011、0.765±0.028，與Sham組比較，各組大鼠左/右側海馬CA1區正常神經元密度比均顯著降低（P＜0.05）；與HI組比較，Iso組、Iso+CNQX組左/右側海馬CA1區正常神經元密度比顯著升高（P＜0.05），Iso+AMPA組無明顯升高或降低（P＞0.05）；與Iso組比較，Iso+CNQX組左/右側海馬CA1區正常神經元密度比無明顯改變（P＞0.05），而Iso+AMPA組左/右側海馬CA1區正常神經元密度比明顯降低（P＜0.05）。

3 討論

HIBD的發病機制復雜，目前尚無有效的臨床治療方法。本課題組前期研究結果顯示，在新生大鼠缺血缺氧性腦損傷后6 h內，1.5%異氟醚后處理30 min，可以明顯減輕大鼠的腦損傷程度，證明異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有腦保護作用。研究還從細胞能量代謝方面進行探究，對缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠給予了mPTP特異性抑制劑環孢素A，對缺血缺氧性腦損傷大鼠有保護作用，但并不與異氟醚后處理有疊加作用，而給予mPTP的特異性開放劑蒼術苷后可以逆轉異氟醚后處理的腦保護作用，證明異氟醚后處理可能是通過抑制mPTP的開放起到腦保護作用［13］。而細胞能量代謝紊亂與細胞內Ca2+水平異常有密切聯系，因此本實驗研究了對細胞內Ca2+水平起關鍵作用的AMPA受體。結果顯示，對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠給予異氟醚后處理可以起到腦保護作用，同時給予AMPA受體拮抗劑CNQX，與異氟醚后處理對大鼠的腦保護作用并無疊加作用，但給予興奮性神經遞質AMPA可以逆轉異氟醚后處理的腦保護作用。

目前研究普遍認為，缺血缺氧時谷氨酸大量釋放而消除能力降低，細胞外谷氨酸濃度大幅度升高達到毒性水平，谷氨酸受體過度活化，Ca2+大量內流導致細胞腫脹凋亡，而這一過程主要由AMPA受體介導［14，15］。本實驗應用的CNQX為競爭性拮抗AMPA受體，抑制AMPA受體的過度活化，穩定其在突觸后膜的穩定表達，減少細胞內Ca2+超載從而起到腦保護作用。有文獻證明，單純對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠給予AMPA受體拮抗劑可降低腦細胞內炎癥反應及過氧化物水平，減輕腦損傷程度［7］。而興奮性神經遞質AMPA則激動AMPA受體，使其發生構型的改變而造成損傷作用，亦有研究表明其可造成腦組織損傷［16］。本實驗結果顯示，對缺血缺氧性腦損傷的新生大鼠進行異氟醚后處理可明顯改善腦損傷程度，缺血缺氧7 d時海馬CA1區左側正常神經元數量明顯增加。而同時給予AMPA受體拮抗劑CNQX與異氟醚后處理，前者并未增強異氟醚后處理的保護作用，即二者并無疊加效應。而給予興奮性神經遞質AMPA與異氟醚后處理，該組左側正常神經元數量明顯低于異氟醚后處理組，表明AMPA逆轉了異氟醚后處理的腦保護作用。

綜上所述，異氟醚后處理對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷具有保護作用，其可能通過抑制AMPA受體的過度活化而發揮作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.011

R651.15

A

1002-266X（2016）25-0036-04

國家自然科學基金資助項目（81171782）。

趙平（E-mail：zhaop@sj-hospital.org）

2015-12-20）