金匱腎氣丸對糖尿病大鼠腎臟細胞Bax Bcl-2表達的影響

姚穎莎 何敏菲 方慧倩 鄭燕 張躍明★

金匱腎氣丸對糖尿病大鼠腎臟細胞Bax Bcl-2表達的影響

姚穎莎 何敏菲 方慧倩 鄭燕 張躍明★

目的 探討金匱腎氣丸對糖尿病（DM）大鼠腎小管細胞凋亡及蛋白Bcl-2/Bax表達的影響。方法 采用小劑量高脂、高糖喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg造成2型糖尿病（DM）大鼠模型，金匱腎氣丸溶液［800mg/（kg·d）］灌喂8周。8周后實施開腹手術取左腎組織，采用免疫組化檢測腎組織Bcl-2、Bax蛋白的表達。結果 與正常對照組比較，糖尿病組和金匱腎氣丸治療組腎臟細胞Bax和Bcl-2表達均增強，Bcl-2/Bax明顯降低（P＜0.05），金匱腎氣丸治療組較糖尿病組Bax表達減弱，Bcl-2表達增強，Bcl-2/Bax增加（P＜0.05）。結論 金匱腎氣丸可能通過影響凋亡相關基因Bcl-2和Bax的表達而抑制腎臟細胞凋亡，從而發揮腎臟保護作用。

糖尿病腎病 金匱腎氣丸 細胞凋亡 Bcl-2 Bax

糖尿病腎病（diabetes nephropathy，DN），又稱腎小球硬化癥，是糖尿病最常見和嚴重的微血管并發癥之一。研究表明，細胞凋亡密切參與了DN的發生［1］。金匱腎氣丸由東漢醫圣張仲景創制，記載于《金匱要略》，是治腎氣不足諸證的第一方。近年來發現其在DN的治療中起著重要作用［2］。而關于金匱腎氣丸對糖尿病腎臟細胞凋亡的報道不多。本實驗自2014年11月至2015年10月研究金匱腎氣丸的抗凋亡作用并探討其防治 DN的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡健康Wistar大鼠，雄性，體重200～250g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 材料 鏈脲佐菌素（STZ），美國SIGMA公司；金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發張股份有限公司制藥廠）；Bcl-2和Bax免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術有限公司）；血糖儀（強生公司穩豪倍優型產品）。

1.3 分組、造模與給藥 21只8周齡Wistar大鼠，隨機分為正常組、糖尿病組（模型組）、金匱腎氣丸組（治療組），每組7只。給予普通飼料。對B、C組大鼠只給予高脂、高糖喂養（10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽，66.5%常規飼料），喂養6周后，禁食12h，腹腔注射30mg/kg STZ溶液，對照組注射等量枸櫞酸緩沖液。3d后取尾靜脈血測定血糖，隨機血糖≥16.7mmol/L，為2型糖尿病模型成功。成模后各組大鼠繼續原飼料喂養控制血糖，C組采用適量金匱腎氣丸［800mg/（kg·d）］溶液（溶于生理鹽水）灌喂，A、B組用等量生理鹽水灌喂，各8周。

1.4 腎組織切片制備 處死動物，摘取動物腎臟于福爾馬林中固定，常規石蠟包埋，切片，用于腎臟細胞凋亡以及Bcl-2與Bax表達檢測。

1.5 免疫組化法檢測腎臟Bcl-2與Bax蛋白的表達 操作按說明書，一抗為兔抗大鼠的Bcl-2和Bax單克隆抗體（1：50稀釋），二抗為生物素化羊抗兔IgG（1：100稀釋），以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，光鏡觀察，以胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。在每張切片上隨機選擇10個區域，每個區域計數100個細胞，統計出每組切片Bcl-2、Bax陽性細胞百分數［3］。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件包。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠腎組織Bcl-2、Bax陽性細胞百分數及Bcl-2/Bax比值變化情況 與A組比較，B組大鼠腎臟Bcl-2、Bax表達明顯增多（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值明顯降低（P＜0.05）；C組與B組比較，C組Bax表達減少（P＜0.05），而Bcl-2表達、Bcl-2/Bax比值均明顯增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組Bcl-2，Bax陽性細胞百分數及Bcl-2/Bax比值變化（±s）

表1 各組Bcl-2，Bax陽性細胞百分數及Bcl-2/Bax比值變化（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05

組別nBcl-2（%）Bax（%）Bcl-2/Bax正常組72.09±0.1201.61±0.0691.3±0.084模型組720.85±1.233*36.94±1.272*0.57±0.041*治療組732.97±1.934*#29.20±2.351*#1.14±0.111*#

3 討論

DN作為糖尿病常見而難治的微血管并發癥，也是糖尿病患者致殘和致死的主要原因之一［4］。細胞凋亡在DN發生發展中的作用逐漸受到重視［3～6］，較多文獻報道糖尿病腎病的發生發展與腎小管細胞凋亡密切相關［7］。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡（progranmaed cell death，PCD），指細胞基因調控的一種自主性的自殺現象，是一種細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身程序，自我結束生命的方式［8］。細胞凋亡的發生是由體內的凋亡分子所介導。Bcl-2及Bax是調節細胞凋亡的一組基因［9］，Bcl-2是一種重要的細胞生存基因，功能主要是抑制細胞凋亡，Bax是拮抗Bcl-2的促凋亡因子，細胞內bax和bcl-2的比例調節了細胞凋亡的發生［10～12］。

金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、丹皮、附子、桂枝八味藥組成。由東漢醫圣張仲景創制，記載于《金匱要略》，是治療腎氣不足諸證的第一方。張仲景用其來治療多種病證，其中之一便是“男子消渴，小便反多，以飲一斗者，小便一斗”。金匱腎氣丸滋腎陰而補腎陽，以陰中求陽而達到陰陽互生的目的［13］。DN為慢性消耗性疾病，久病損耗腎中精氣。金匱腎氣丸填補腎中真陰真陽，恢復氣血陰陽平衡，從根本上保護了腎功能。本實驗通過金匱腎氣丸干預糖尿病大鼠8周后發現，腎臟細胞凋亡數目減少，Bcl-2表達量和Bcl-2/Bax明顯增加，而Bax表達水平明顯降低，說明金匱腎氣丸可能通過改變凋亡基因Bcl-2和Bax的表達，升高Bcl-2/Bax的比值抑制糖尿病腎臟細胞凋亡，從而起到保護腎臟的作用。

本實驗通過對Bcl-2和Bax的分析，發現腎臟細胞的凋亡參與了糖尿病腎臟病變的發生發展，同時金匱腎氣丸可以通過抑制糖尿病大鼠腎臟細胞的凋亡，延緩糖尿病大鼠腎臟病變的發生和發展，對今后金匱腎氣丸用于治療DN具有重要的臨床意義。

1 Soldatos G， Cooper M E. Diabetic nephropathy： important pathophysiologic mechanisms.Diabetes Res Clin Pract，2008，82（Suppl 1）：S75～79.

2 金智生，陳雪，李甜.金匱腎氣丸對實驗性2型糖尿病腎病大鼠血清TGF-β1、CTGF的影響.中醫藥學報，2012，40（3）：136～139.

3 姜棟棟，李文通，張偉棟.前列地爾調節bcl-2，bax抑制大鼠糖尿病腎病腎小管細胞凋亡.Acta Acad Med Weifang，2011，33（2）：146～148.

4 張艷玲，周波，張立凈，等.中藥治療糖尿病生病的作用機制研究進展.中醫藥學報，2009，37（6）：105～108.

5 Chakradhar Velagapudi，Basant S.Bhandari，Sherry Abboud-Werner，et al.The Tuberin/mTOR pathway promotes apoptosis of tubular epithelial cells in diabetes.J Am Soc Nephro，2011，22（2）：262～273.

6 Wagrowska Danile M，Danile wicz M.A study of apoptosis in human glomerulonephritis as determine by in situ non-radioative labeling of DNA stand breaks.Acta Histochem，1997，99（3）：257～266.

7 Samy L Habib.Diabetes and renal tubular cell apoptosis.World Journal of Diabetes，2013，4（2）：27～30.

8 Hans I，Kim YS，Kim TH.Rore of apoptotic and necrotic cell death under physiologic conditions.BMB Rep，2008，41（1）：1～10.

9 Ortriz A，Ziyadeh FN，Neilson EG.Expression of apoptosis-regulatory gene in renel proximal tubular epithelial cells exposed to high ambient glucose and in diabetic kidneys.Invest Med，1997，45（2）：50～56.

10 趙燕，楊秋萍，肖華，等.燈盞花素對糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡及bax、bcl-2表達的影響.中國糖尿病雜志，2009， 17（11）：864～867.

11 Mishra R，Emancipator SN，Kem T，et al.High glucose evokes an intrinsic proapoptotic signaling pathway in mesangial cells.Kidney Int，2005，67（1）：82～93.

12 孫潔，田林紅，王收寶，等.黃苓苷對糖尿病大鼠腎臟細胞凋亡及其bcl-2和bax表達的影響.實用醫學雜志，2001，23（5）：757～760.

13 王新玲，李月彩，侯穎春.金匱腎氣丸抗自由基和細胞凋亡的作用.第四軍醫大學學報，2000，21（10）：1209～1211.

Objective To investigate the effects of Jinkui Shenqi Wan on the renal cell apoptosis in the diabetic rats. Methods Diabetic rat models were induced by high-lipids and high-sucrose feeding for a month and single intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ），then were administrated with 800 mg/（kg·d）of Jinkui Shenqi Wan for 8 weeks.At week 8，rat left kidneys were taken and the change of Bcl-2/Bax was detected by immunohistochemistry. Results The level of Bcl-2，Bax protein and kidney tubules cells apoptosis index were higher，while Bcl-2/Bax ratio was lower in Jinkui Shenqi Wan and DM group than those in normal control group（P＜0.05）.The levels of Bcl-2 protein，Bcl-2/Bax ratio and kidney tubules cells apoptosis index were higher in Jinkui Shenqi Wan group than those in DM group（P＜0.05），and Bax expression level was reduced compared to that of DM group（P＜0.05）. Conclusion Jinkui Shenqi Wan may inhibit the apoptosis of renal ceils in diabetic rats by regulating the expressions of Bcl-2 and Bax.

Diabetes nephropathy Jinkui Shenqi Wan Cell apoptosis Bcl-2 Bax

浙江省大學生科技創新活動計劃（2014R410007）

310000 浙江中醫藥大學