PCR在自發性腹膜炎快速診斷中的應用

喻長法 葉麗君 章靈敏 段達榮 徐黔寧

PCR在自發性腹膜炎快速診斷中的應用

喻長法 葉麗君 章靈敏 段達榮 徐黔寧

目的 探討聚合酶鏈式反應（PCR）在自發性腹膜炎快速診斷中的應用價值。方法 針對原核微生物16S rRNA基因的高度保守性，設計合成所有細菌、革蘭陰性菌（G-）和革蘭陽性菌（G+）的通用引物，用PCR擴增已知的病原菌，檢測其特異性。用此方法擴增自發性腹膜炎患者的腹水標本，將結果與培養法進行對比分析。結果 通用引物擴增后，已知病原菌均獲得371bp產物。G-菌通用引物擴增后，G-菌均獲得252bp產物，G+菌無相應產物；G+菌通用引物擴增后，G+菌均獲得202bp產物，G-菌無相應產物。PCR方法的陽性率顯著高于培養法（P＜0.05）。結論 PCR檢測細菌16S rRNA基因，具有檢測速度快、敏感性高和結果準確等優點，具有一定的實用價值。

自發性腹膜炎 16S rRNA基因 聚合酶鏈反應

自發性腹膜炎（SBP）是腹腔內及鄰近器官在無需外科處理的細菌感染來源情況下發生的細菌性腹膜炎，是失代償期肝硬化伴腹水患者常見的并發癥［1］。至今為止，SBP的確診主要依賴于腹水培養及腹水常規檢查，但培養陽性率低，耗時長，不能滿足臨床需求。本研究將聚合酶鏈式反應（PCR）技術應用于腹水細菌的快速檢測，取得了較好的效果，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年6月本院感染科和消化內科收治的肝硬化失代償期伴腹水的住院患者共73例，其中男39例，女34例；年齡31～82歲，平均年齡（54.0±13.5）歲。其診斷標準參照2000年西安全國傳染病與寄生蟲病會議制訂的標準［2］。

1.2 臨床標本的采集 無菌條件下抽取患者腹水30ml，10ml用于細菌需氧和厭氧培養，10ml用于腹水生化和常規檢查，10ml用于PCR檢測。

1.3 已知實驗菌株的來源 已知菌株為本院檢驗科微生物室保存的菌株，人類基因組DNA、巨細胞病毒、白色假絲酵母菌由省臨床檢驗中心提供。

1.4 儀器與試劑 9600型PCR反應儀由美國Perkin elmer公司提供，DYY-III型穩壓穩流電泳儀由北京六一儀器廠提供，Gel doc l000型凝膠圖像處理系統由美國BIO-RAD公司提供。PCR試劑盒由大連寶生物公司提供。

1.5 方法 （1）引物設計：所有細菌通用引物為：上游5'-TGCGGTTGGATCACCTCCT-3'，下游5'-TCCCCACCTTCCTCCAGTT-3'。革蘭陰性菌（G-）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-CCCGGCTTCGTATTCACC-3'。革蘭陽性菌（G+）引物：上游5'-GCATCAGGTCAAGTCATC-3'，下游5'-GGCTTCTGCTGTTACAAA-3'。（2）反應體系和反應條件：PCR反應體系為：2.5mmol/L dNTPs 4μl，25 mmol/L MgCl24μl，10×Buffer 5μl，20μmol/L引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，模板5.0μl，加無菌雙蒸餾水至50μl。反應條件為：94℃預變性6 min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃ 2min共循環30次，最后延伸10min。（3）基因產物分析：將PCR擴增產物2μl與1μl上樣緩充液充分混勻后，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），經100 V電壓電泳30min，將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠圖像分析儀上，紫外線透射掃描觀察并拍照保存。

1.6 統計學分析 采用SPSS16.0統計軟件。兩方法陽性率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌通用引物的特異性分析 已知細菌16S rRNA基因經PCR擴增后均有371 bp的產物，而人類基因組DNA、巨細胞病毒和白色假絲酵母菌無對應產物，見圖1。

2.2 G-菌通用引物擴增結果 G-菌經其通用引物擴增后，均獲得252bp產物，而G+菌無相應產物，見圖2。

圖1 已知病原菌PCR擴增后產物電泳圖

圖2 革蘭陰性菌通用引物擴增后產物電泳圖

2.3 G+菌通用引物擴增結果 G+菌經其通用引物擴增后，均獲得202bp產物，而G-菌無相應產物，見圖3。

圖3 革蘭陽性菌通用引物擴增后產物電泳圖

2.4 臨床標本兩方法陽性率的比較 培養法檢測11例陽性，PCR方法檢測25例陽性，PCR方法陽性率顯著高于培養法（P＜0.05），見表1。

表1 兩種方法敏感性比較

2.5 臨床標本兩方法檢測結果比較 培養法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型與其一致。另PCR方法分型9株G-，5株G+，培養法為陰性結果。

3 討論

SBP是肝硬化腹腔積液常見的嚴重并發癥，發生率可達10%～25%，病死率高達50%，而早期臨床表現不典型，快速診斷和積極治療是挽救患者生命的關鍵［3］。

16S rRNA基因序列具有總長度適宜、多信息和多拷貝等特點，存在于所有原核微生物基因組中，故在細菌學研究中常被作為研究的靶分子，用于病原微生物的快速鑒定。借助于16S rRNA基因的保守區，可設計出多條引物，用于細菌感染性疾病的快速診斷。馮群燦等［4］將16S rRNA基因檢測應用于慢性非細菌性前列腺炎患者的前列腺液，擴增出1032bp的產物，16S rRNA基因檢測陽性率為38.5%，說明在慢性非細菌性前列腺炎的前列腺液中，仍有許多病原菌存在的可能。張芳等［5］設計一條通用引物，用于新生兒膿毒癥早期診斷，PCR檢測細菌DNA均得到預期的約371 bp大小的擴增產物。陳群偉等［6］研究抗生素應用對16S rRNA基因芯片檢測腹水細菌的影響，患者使用抗生素后，培養法陽性率明顯降低，而16S rRNA基因芯片幾乎不受影響且陽性率顯著高于培養法。潘紅英等［7］應用定量PCR聯合基因芯片檢測腹水細菌16 SrRNA診斷自發性細菌性腹膜炎，定量PCR聯合基因芯片檢測陽性率為22.4%，其中G-菌9份，G+菌8份；腹水細菌培養陽性率為7.9%，均為G-菌，兩種方法差異有統計學意義（P＜0.05）。湯偉等［8］用半巢式PCR檢測細菌并革蘭分型，半巢式PCR陽性率顯著高于培養法，革蘭分型與培養法吻合度高。

本研究采用細菌通用引物擴增已知病原菌，均獲得371bp擴增產物，G-菌通用引物擴增后，G-菌均獲得252bp產物，G+菌無相應產物；G+菌通用引物擴增后，G+菌均獲得202bp產物，G-菌無相應產物，證實細菌通用引物、G-菌和G+菌的通用引物具有特異性。培養法陽性率為15.07%，PCR方法陽性率為34.25%，PCR方法陽性率顯著高于培養法（P＜0.05）。對兩種方法革蘭分型對比分析可知，培養法7株G-菌，4株G+菌，PCR分型與其一致，另PCR方法分型9株G-，5 株G+，培養法為陰性結果，證明PCR分型結果可靠。

總之，16S rRNA基因應用于SBP患者腹水細菌檢測，具有檢測速度快、特異性高等特點，并能將病原菌進行初步分型，指導SBP抗生素的選擇方面可能有重要的應用價值，尤其是對腹水培養陰性的臨床感染患者，顯著優于腹水培養方法，可以提高SBP的確診率，有利于臨床及時診斷和治療。

1 Runyon BA.Practice Guidelines Committee，American Association for the study Liver Disease （AASLD）.Management of adult patients with ascites due to cirrhosis .Hepatology，2009，49（6）：2087～2107.

2 中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.傳染病信息，2000，13（4）：141～142.

3 陳銀蕓，霍繼榮.乙型肝炎肝硬化并發腹膜炎患者血清及腹腔積液TNF-α、IL-8、IL-18水平臨床意義的探討.中國當代醫藥，2010，17（14）：32～34.

4 馮群燦，戎永楚. 16S rRNA基因檢測在慢性非細菌性前列腺炎患者中的應用 .現代實用醫學，2013，25（5）：574～576.

5 張芳，宋力，黨力亨，等.基因檢測在新生兒膿毒癥早期診斷中的價值.實用兒科臨床雜志，2011，26（10）：764～766.

6 陳群偉，潘宏儀，孫洪運，等.抗生素應用對16S rRNA基因芯片檢測腹水細菌的影響 .國際流行病學傳染病學雜志，2012，39（2）：92～94.

7 潘紅英，諶翠容，尚世強，等.定量PCR聯合基因芯片檢測腹水細菌16SrRNA診斷自發性細菌性腹膜炎.中華肝臟病雜志，2011，19（4）：297～300.

8 湯偉，汪曉鶯，馬國光，等.快速檢測細菌并革蘭分型的半巢式聚合酶鏈反應及其初步應用 .中國人獸共患病雜志，2005，21（2）：164～168 .

Objective To explore the application value of PCR in rapid diagnosis spontaneous peritonitis. Methods PCR primers of all bacteria，gram-negative and gram-positive were synthesized according to the high conservative region of 16S rRNA gene in bacteria.，the known pathogens were amplified by PCR to test its specificity.Ascites samples were tested by PCR，and PCR results were compared with culture method. Results The known pathogens obtained 371 bp product after general primer amplification.Gram-negative bacteria obtained 252 bp product after gramnegative bacteria general primer amplification，while gram-positive bacteria without corresponding product. Gram-positive bacteria obtained 202 bp product after gram-positive bacteria general primer amplification，while gram- negative bacteria without corresponding product. The positive rate of PCR method was significantly higher than that of culture method（P＜0.05）. Conclusion PCR technology has advantages of short detection time，high sensitivity and accurate in identifying 16S rRNA gene of bacteria.

Spontaneous bacterial peritonitis（SBP） 16S rRNA gene Polymerase chain reaction（PCR）

·臨床研究·

浙江省臺州市黃巖區科技局資助項目（201305926）

318020 浙江省臺州市第一人民醫院