探討FCST在婦女陰道分泌物分離的白色念珠菌藥物敏感性檢測中的應用

李愛娟 吳宗寶 張傳飛 周永列★ 胡慶豐 呂火烊

探討FCST在婦女陰道分泌物分離的白色念珠菌藥物敏感性檢測中的應用

李愛娟 吳宗寶 張傳飛 周永列★ 胡慶豐 呂火烊

目的 了解本地區陰道炎婦女念珠菌感染情況及流式細胞術藥物敏感試驗（FCST）檢測念珠菌對常用唑類抗真菌藥物敏感性的可行性。方法 對2864例陰道炎婦女的陰道分泌物進行念珠菌的分離培養鑒定，FCST檢測分離的白色念珠菌對氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的藥物敏感性并與細菌自動鑒定及藥敏儀（ATB）檢測結果進行比較。結果 2864份陰道分泌物分離念珠菌344株，陽性率為11.9%，白色念珠菌285株占82.8%。白色念珠菌對FCA耐藥性較低為3.2%，對VRC和ITR的耐藥率均＞30%。ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的符合率分別為95.1%、88.1%和91.2%。結論 白色念珠菌是本地區農村婦女陰道分泌物的主要病原菌，本地區陰道分泌物分離白色念珠菌對VRC和ITR有一定的耐藥性。與ATB真菌藥敏試驗（ATB-F）比較FCST用于檢測真菌對藥物的敏感性或耐藥性具有快速、準確、敏感等優點，具有臨床應用前景。

流式細胞術 藥物敏感試驗 白色念珠菌 氟康唑 伏立康唑 伊曲康唑

陰道炎是婦女最常見的婦科疾病之一，念珠菌是婦女外陰道感染主要病原體之一［1］。念珠菌屬是一類條件致病菌，又名假絲酵母菌（Candida），屬內包括150多個種，主要以白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌等為主［2］。目前實驗室檢測念珠菌對抗真菌藥物的藥物敏感性常用微量稀釋法、紙片擴散法。國內外已有報道基于流式細胞術快速檢測臨床分離細菌的藥物敏感性的流式細胞術藥物敏感試驗（FCST），具有快速、準確、結果清晰、易于標準化等優點。為了解本地區陰道炎婦女念珠菌感染情況及對FCST檢測念珠菌對常用唑類抗真菌藥物敏感性的可行性，作者對2864例陰道炎婦女的陰道分泌物進行念珠菌的分離培養鑒定，FCST檢測分離到的白色念珠菌對氟康唑（FCA）、伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）的藥物敏感性并與細菌自動鑒定及藥敏儀（ATB）檢測結果進行比較，現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 采集2014年1月至2015年7月來本院婦科和皮膚性病科門診的2864份女性就診者陰道分泌物，年齡20～63歲，平均（34±8）歲。臨床上有外陰不適、瘙癢、白帶增多、異味，小便不適等；2周內未服任何抗生素及局部未用外用藥。

1.2 試劑及儀器 念珠菌顯色培養基購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。FCA、ITR和VRC分別由法國輝瑞公司、比利時楊森公司和愛爾蘭輝瑞公司生產。碘化丙啶購自Sigma，RPMI-1640培養液購自北京海克隆。流式細胞儀為美國BD FACSCalibur，ATB 自動細菌鑒定儀/FUNGUS試紙條為法國梅里埃產品。

1.3 方法 （1）菌株培養與鑒定：標本采集用一次性無菌陰道窺器，擴張陰道，用消毒棉簽取后穹窿分泌物。將分泌物拭子接種于念珠菌顯色培養基，35℃恒溫箱培養24～72h，呈淡綠色為白色念珠菌，藍灰色或鐵藍色為熱帶念珠菌，紫色為克柔念珠菌株，奶油色至白色為光滑念珠菌株。挑取初步鑒定為白色念珠菌菌落用無菌蒸餾水稀釋成相當于2號麥氏管的菌懸液，加250μl稀釋液至C培養基，混勻取135μl菌懸液于真菌鑒定條，ATB讀取結果。（2）ATB真菌藥敏試驗（ATB-F）：無菌接種環挑取1～3個ATB 自動細菌鑒定儀鑒定為白色念珠菌菌落用無菌蒸餾水制備相當于2號麥氏管的菌懸液，吸取20 μl 稀釋液至ATB-F混勻，分別加135μl菌懸液于含ATB藥敏條（法國生物梅里埃公司）的各微孔，無菌礦物油封存后35℃恒溫箱培養24～72h后根據試劑使用說明書提供的判讀標準判讀結果。（3）流式細胞術藥敏試驗（FCST）：參考文獻［3］，各白色念珠菌臨床菌株懸液用RPMI-1640培養液稀釋至1×106/ml。取1ml菌液中分別加入不同終濃度的各抗真菌藥物，加入藥物與濃度見表1。另設1份無藥陰性對照和1份加熱處死的陽性對照。35℃孵育3h。3000r/min 離心5min，取白色念珠菌沉淀加入脫氧膽酸鈉（SDC）溶液20μl，混勻后室溫放置5min。加入濃度為50μg/ml的PI 染液200μl，室溫下染色15min后，加入25 mmol/L 的去氧膽酸鈉20μl后染色5～10min后在流式細胞儀上檢測。流式細胞術分析的門設定和微量稀釋最小抑菌濃度（MICS）判定參考文獻［4］。

2 結果

2.1 念珠菌分離情況 2864份陰道分泌物念珠菌顯色培養陽性344份，無不同念珠菌重疊感染，陽性率為11.9%。其中白色念珠菌285株占82.8%，光滑念珠菌24株占7.0%，熱帶念珠菌22株占6.4%，克柔念珠菌11株占3.2%，星形念珠菌2占0.6%。

2.2 藥敏試驗結果 285株白色念珠菌對3種唑類抗菌素真菌藥物的MICs見表1。

表1 藥敏試驗藥物終濃度及白色念珠菌臨床菌株的MICs

2.3 兩種藥敏試驗比較 285株白色念珠菌分別用ATB-F和FCST檢測對3種唑類抗菌素真菌藥物的敏感性。ATB-F檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的耐藥性分別為3.2%、31.9%和27.7%；用FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的耐藥性分別為3.2%、31.2%和31.2%。ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對FCA、VRC、ITR的符合率分別為95.1%、88.1%和91.2%。

3 討論

念珠菌性陰道炎的發病機制與多種因素有關，如長期服用廣譜抗生素、口服避孕藥和激素、免疫抑制劑等因素誘發感染［5］。國外報道約40%～70%的成年婦女有外陰陰道念珠菌病病史，約5%患者有反復發作，反復發作和頑固難愈與念珠菌的耐藥性密切相關。致病菌種類的分析和藥物敏感性的監測對臨床有著重要意義。近年國內也見臨床病例中真菌、尤其是念珠菌的感染率日趨升高且對一線抗真菌藥物FCA和VRC耐藥性不斷增強［2］。本資料中，2864份女性就診者陰道分泌物念珠菌感染率為11.9%，白色念珠菌占82.8%。白色念珠菌對3種唑類抗真菌藥物除對FCA較敏感（耐藥率為3.2%）外，對其余2種藥物的耐藥率均＞30%，提示對引起陰道炎的真菌應該加強藥敏檢測，防止濫用藥物和非規范化自行使用藥物。

美國國家臨床實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的真菌藥敏試驗方法主要有常量稀釋法、微量稀釋法、紙片擴散法［3］。本實驗室真菌藥敏試驗常用紙片擴散法，與稀釋法比紙片擴散法較為簡便，但培養周期長、易污染、有拖尾現象等缺點存在；近年有實驗室使用的E-test檢測真菌藥物敏感性，雖簡便，但仍需較長實驗時間且主觀因素易影響結果判斷［6］。因此，建立快速、準確、易于標準化的真菌藥敏試驗方法具有重要的臨床意義。

本資料中，作者從陰道炎婦女陰道分泌物中分離到的285株白色念珠菌，用文獻建立的FCST檢測了對FCA、ITR和VRC的敏感性并與ATB-F法進行比較，ATB-F與FCST檢測285株白色念珠菌對3種唑類抗真菌藥物符合率較高均在90%左右，對ITR的符合率高達95.1%，提示FCST與ATB-F測定白色念珠菌的藥物敏感性有較好的一致性。FCST檢測白色念珠菌對抗真菌藥物藥敏試驗可在0.5 h內出結果，而用稀釋法、微量稀釋法、紙片擴散法需＞2d時間。當然目前使用的FCST檢測白色念珠菌方法與參數參考文獻獲得，雖然結果表明文獻方法適用于本實驗室，但要在更多種類的真菌甚至其他細菌使用流式細胞術檢測其藥物敏感性還有待于條件的進一步摸索以利于建立標準化程序。

1 Nenadi? D，Pavlovi? MD.Value of bacterial culture of vaginal swabs in diagnosis of vaginal infections. ojnosanit Pregl，2015，72（6）：523～528.

2 Shi XY，Yang YP，Zhang Y，et al.Molecular identification and antifungal susceptibility of 186 Candida isolates from vulvovaginal candidiasis in southern China.J Med Microbiol， 2015，64（Pt 4）：390～393.

3 Zhou X，Brown CJ，Abdo Z，et al.Differences in the composition of vaginal microbial communities found in healthy Caucasian and black women.ISME J， 2007，1（2）：121～133.

4 Lanchares JL，Hemandez ml.Recurrent vaginal candidiasis changes in etiopathogenical patterns.Int J Gynaecol Obstet，2000，71（Supple 1）：S29～35.

5 Arikan S.Current status of antifungal susceptibility testing methods.Med Mycol， 2007，45（7）：569～587.

6 趙心懋，徐英春，段瓊，等.氟康唑體外抗菌活性及五種體外敏感試驗方法的比較.中華檢驗醫學雜志，2006，29（2）：128～132.

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