巴戟天多糖對骨質代謝相關基因的影響

朱孟勇 吳洋洋

巴戟天多糖對骨質代謝相關基因的影響

朱孟勇 吳洋洋

目的 研究巴戟天多糖對骨質代謝相關基因的影響。方法 使用雙能量X射線吸光測定法（DEXA）測定骨礦質元素含量（BMC）和使用一個Hologic QDR 1000和Hologic’s小動物程序測定骨礦質元素密度（BMD）。按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。結果 藥理學分析表明能顯著提高鼠骨的礦質元素密度和含量，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關基因 （BMP-2、Cbfal、Dmp1、rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達。結論 藥理學試驗表明巴戟天多糖能刺激骨代謝相關基因的表達及提高骨礦質元素密度和含量。

巴戟天多糖 骨代謝相關基因

骨質疏松癥是以骨質損失和骨組織微結構退行性變化為特點的骨病，伴隨高齡人口的增加，發病率不斷上升，是目前影響老年人生活質量的重要疾病之一，骨質疏松的發生與環境、遺傳、內分泌系統變化及體內氧自由基的損傷有關。中醫藥防治骨質疏松具有一定的作用，巴戟天是亞洲地區治療骨科疾病的傳統中藥，對于免疫反應引起的骨損傷及退行性骨病具有良好的治療作用，其中多糖是發揮藥理作用的主要成分，本文作者自2012年6月至2014年6月研究巴戟天多糖對骨礦質元素密度和含量的影響，探討其對骨基因表達的影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2013年3月，作者于省內一藥店購得巴戟天多糖樣品。

1.2 動物和處理 32只健康雌性wistar大鼠來自浙江中醫藥大學試驗動物中心。試驗開始前，鼠養育于籠中，溫度24℃，相對濕度 50%～60%，試驗期間維持12h 光/暗循環，在藥物處理前7d以實驗鼠適應試驗條件。將大鼠隨機分成4組：對照組（I組）、模型組（II組）、低劑量組（III組）、高劑量組（IV組），每組各8只。模型組、低劑量組及高劑量組大鼠切除雙側卵巢后飼養4周建立骨質疏松大鼠模型，對照組及模型組灌胃生理鹽水2ml/（kg·d），低劑量組及高劑量組灌胃巴戟天多糖溶液2ml/（kg·d），濃度分別為50mg/ml及150mg/ml，連續給藥30d后處死大鼠，取下脛骨，脛骨組織樣本立即冷凍在液氮中，貯藏溫度-80℃。

1.3 骨質測定 使用雙能量X射線吸光測定法（DEXA）測定骨礦質元素含量（BMC），使用Hologic QDR 1000和Hologic's小動物程序測定骨礦質元素密度（BMD）。在不同測試中心由不同的檢測者使用Hologic QDR 1000對鼠后腿重復檢測。然后鼠腿燃燒成灰，余礦物質稱重，即測定鼠腿骨礦質元素合量。后將骨灰溶解于0.1mol/L鹽酸中，由不同檢測者用標準比色法測定鈣、鎂、磷的濃度。DEXA的測試精度由灰重量與骨礦物質濃度間的相關系數及重量比較決定。

1.4 mRNA表達 按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。在260/280下，通過分光光度計分析RNA純度，RNA數量在260 nm下確定。在熱模擬實體中（Gene Amp? PCR system 2400，Perkin-Elmer，Roche，NJ，USA），cDNA 由240ng的總RNA經兩步逆轉錄聚合酶鏈式反應合成試劑盒 （RT-PCR） 合成。特異的寡核苷酸序列是：BMP-2 F：5'-TCAGCGAGTTTGAGTTGAGG-3'。R：5'-GATGGCTTCTTCGTGATGG-3'；Cbfal F：5'-CCAAGAAGGCACAGACAGAA-3'。R：5'-TGGCTCAGATAAGAGGGGTAAG-3'；Dmp1 F：5'-CTGTCCTGTGCTCTCCCTGT-3'。R：5'-TCGTCTTCATCCTCCTCCTT-3'；rRANKL F：5'-GGCTGGGCCAAGATCTCTAAC-3'。R：5'-GTGTCCAACCCTTCCCTGTTG-3'；rALP F：5'-CCTTGAAAAATGCCCTGAAA-3'。R：5'-CTTGGAGAGAGCCACAAAGG-3'；rOPGF：5'-CTGTGAAAGCAGTGTGCAACG-3'。R：5'-AGGTTCTTGCACAGCTTCACC-3'；rPPARγ2 F：5'-CCCTGGCAAAGCATTTGTAT-3'。R：5'-ACTGGCACCCTTGAAAAATG-3'；GAPDH F：5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3'。R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3'。為測定合成產品的線性范圍和精確的半定量分析，使用PCR動態測試和循環測定法。在95℃維持2min有30～35變性循環。在TA退火1min，72℃底物延長。反應最后在72℃延長10 min。伴隨RT-PCR 反應，排除空白對照 （無RNA 模板RT-PCR） 和RT（-） 反應 （無逆轉錄PCR）。PCR 產品在1.5%瓊脂糖硅膠中經電泳分析，并經溴化乙錠顯色。使用photographs和圖像分析軟件（Gel Documentation InGenius? L，Bio-Rod Lab，Hercules，CA，USA）進行定性分析。The relative amount of BMP-2，Cbfal，Dmp1，rRANKL，rALP，rOPG，rPPARγ2 mRNA表達的相對量通過與GAPDH比較計算。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 巴戟天多糖對大鼠體重、BMD和BMC的影響 見表1。

表1 巴戟天多糖對卵巢切除鼠體重、BMD和BMC的影響（±s）

表1 巴戟天多糖對卵巢切除鼠體重、BMD和BMC的影響（±s）

注：與I組比較，*P＜0.01；與II組比較，#P＜0.01

組別體重（g）BMD （g/cm2）BMC （g）I組346.1± 16.50.241±0.0090.573±0.024 II組350.2±22.10.297±0.013*0.602±0.017 III組347.8±19.30.328±0.011*0.643±0.021# IV組343.8±25.10.352±0.013*0.692±0.030#

2.2 巴戟天多糖對鼠骨代謝相關基因表達的影響 與正常對照組大鼠比較，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關基因 （BMP-2、 Cbfal、Dmp1、 rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達。在這些表達中，BMP-2、Cbfal、rRANKL、rALP 和 rPPARγ2 mRNA表達水平隨巴戟天多糖處理濃度的增加而升高。

3 討論

與其他骨形態發生蛋白類似，BMP-2 在骨與軟骨發育過程中發揮著重要的作用［1］。其與hedgehog、TGF beta 信號路徑及 cytokine-cytokine 受體相互作用，亦與心肌細胞分化和內皮細胞向間葉細胞過渡相關。Core-binding 因子（Cbfal）也稱作Pebp2aA（多瘤病毒提升蛋白） 或AML3 （急性骨髓性白血病），屬于runtdomain 基因家族的轉錄因子之一［2］。Cbfal/Pebp2aA 控制成骨細胞中大量基因的表達［3］，Cbfal/Pebp 2a A-缺乏會導致骨發育延緩［4，5］。DMP1 是一個骨礦化的主要調節因子，其在成骨細胞向骨細胞過渡中發揮著重要作用。可能通過礦化調節，DMP1在骨細胞調節機械應力方面發揮著重要作用［6］。核因子 kappa-B 配體（RANKL）的受體也稱為腫瘤壞死因子，TNF-相關激活細胞因子 （TRANCE）、骨保護素配體 （OPGL）和骨細胞分化因子 （ODF）、核因子 kappa-B 配體 （RANKL）的受體激活是一個編碼人體TNFSF11基因的蛋白質［7，8］。RANKL 在骨代謝過程中和必需的表面分子 （也稱作 CD254）能在骨細胞中發現，其能激活破骨細胞，破骨細胞與骨再吸收相關。ALP是成骨細胞表型信號，這一基因的時間表達說明在機械張力下MSCs向成骨細胞短期分化［9］。在骨微環境中，ODF mRNA/OPG mRNA決定了骨代謝的方向［10］（合成代謝或分解代謝）。過氧化物酶體增殖激活受體 γ2 （PPARγ2）是核受體轉錄因子家族的成員，其能誘導多能性成骨細胞脂肪形成。如果PPARγ2在破骨細胞中表達，能抑止成熟破骨細胞表型和誘導脂肪細胞相關基因的表達［11］。

近年來，從生物中（蘑菇、藻類、地衣、高等植物）分離的多糖由于低毒性和較好的藥用價值，受到生物醫藥科研人員的廣泛關注［12］。雖然尚未完全理解這些物質的作用機制，但可以確定這些機制與免疫力相關［12］。這些生物多糖的免疫刺激、抗腫瘤、抗菌和其他的治療效果是機體通過刺激巨細胞和調節補體系統實現的［13］。

巴戟天是一種著名的中草藥，在古代中國，用其治療一系列的病癥，包括消化不良、高血壓、呼吸系疾病及免疫力低下等［14］。巴戟天的主要生物活性物質是蒽醌類，此成分具有抗HIV病毒、抗炎、鎮痛、抗菌、抗氧化、抗突變活力的作用［15］。

作者采用DEXA測定BMC和使用Hologic QDR 1000和Hologic's小動物程序測定BMD。按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。藥理學分析表明能顯著提高實驗大鼠BMD和BMC，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關基因 （BMP-2、Cbfal、Dmp1、rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達。藥理學試驗表明，巴戟天多糖能夠刺激骨相關基因的表達。

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Objective To explore the effect of Morinda officinalis polysaccharides on bone- related genes metabolism. Methods Using dual energy X-ray ceiling light measure （DEXA） method for the determination of bone mineral content （BMC） and using a hologic QDR 1000 and hologic 's small animal procedures for the determination of bone mineral density （BMD）. According to the RNA Isolation Kit specification to isolate RNA. Result Pharmacological analyses show can significantly improve bone mineral density and the content of elements，Morinda officinalis polysaccharides can increase the expression of bone- related genes （BMP-2，Cbfal，Dmp1，rRANKL，rALP，rOPG，rPPARγ2 mRNA）. Conclusion Pharmacological tests show that Morinda officinalis polysaccharides can stimulate the expression of bone- related genes metabolism and improve bone mineral density and content of elements.

Morinda officinalis polysaccharides Bone- metabolism-related genes

浙江省自然科學基金資助（Ly15H270008）

310006 浙江省中醫藥大學附屬第一醫院骨傷科