鹽酸小檗堿與氫氧化鈣對白色念珠菌生物膜的體外抑制作用

李福明 汪洋★

鹽酸小檗堿與氫氧化鈣對白色念珠菌生物膜的體外抑制作用

李福明 汪洋★

目的 評價中藥有效成分鹽酸小檗堿與口腔常用根管消毒藥物氫氧化鈣對白色念珠菌生物膜作用的效果。方法 在96孔培養板形成白色念珠菌生物膜，用甲基四氮鹽（XTT）減低法檢測鹽酸小檗堿、氫氧化鈣兩種藥物對白色念珠菌生物膜活性的影響，用結晶紫含量測定法檢測兩種藥物對白色念珠菌生物膜生物量的影響。結果 鹽酸小檗堿在濃度為125 mg/L時使白色念珠菌生物膜活性及生物量分別減少（91.6±3.3）%和（94.2±2.5）%，生物膜已基本無活性，抑制效果優于氫氧化鈣。結論 鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜具有抑制作用，為口腔根管消毒藥物臨床應用提供理論依據。

鹽酸小檗堿 氫氧化鈣 白色念珠菌 生物膜

近20年來，隨著癌癥放、化療和器官移植患者的增加，免疫抑制藥和廣譜抗生素的大量使用，以及插管等醫學材料使用的增多，白色念珠菌病的發病率增加近40倍，其中相當一部分與白色念珠菌形成生物膜密切相關。白色念珠菌也是人口腔中的常見共生真菌，其易粘附于植入材料表面，如義齒、種植體及導管，并在其上形成生物膜［1］。尋找以生物膜為靶向的藥物是近年的研究熱點，國內外研究大都集中在抗生素及抗真菌的化學藥物［2］。本研究自2014年5月至2015 年5月探討中藥黃連的主要有效成分鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜抑制效果，為口腔臨床治療真菌感染性疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 （1）實驗材料：鹽酸小檗堿標準品（中國食品藥品檢定研究院）、腦心浸液瓊脂培養基（杭州天和微生物試劑有限公司）、二甲基亞砜（天津市科密歐化學試劑有限公司）、96 孔板、6 孔板（美國BD公司）。（2）試劑：蛋白胨（北京奧博星生物技術責任有限公司），酵母提取物（Oxoid公司）酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）液體培養基：酵母提取物10.0 g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g、蒸餾水1000ml，分裝后121℃，15min高壓滅菌。RPMI 1640培養液（美國GIBCO公司），甲基四氮鹽（XTT）粉（上海生工生物工程有限公司），甲萘醌溶液（上海寶泰克生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法 （1）臨床菌株提取鑒定：杭州市口腔醫院就診患者，經診斷為慢性根尖炎病例，無菌紙尖于患牙根管內取樣，用CHROMagar CandidaTM鑒定、分離白色念珠菌株。（2）標準白色念珠菌菌液及抗菌劑應用液的配制：從沙堡培養基上取單菌落白色念珠菌接種在YPD（2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖）液體培養基中，37℃搖床培養24h，收集YPD培養液中對數期生長狀態的真菌細胞，PBS（pH 7.2）沖洗3遍，用RPMI1640（美國GIBCO公司）培養液調整菌懸液濃度為1×107個細胞/ml，OD520nm= 0.38，標準菌懸液制備后即刻使用。將鹽酸小檗堿以RPMI1640為溶劑配制成濃度為1000mg/L的原液，按二倍稀釋法得到15.63～500mg/L共6個濃度梯度的抗菌劑應用液，一組設計添加菌液加入實驗組，另一組設計不加菌液作為陰性對照組。以不加抗菌劑的RPMI1640作為陽性對照組，設計加入菌液。氫氧化鈣組用RPMI1640為溶劑配制成10%的飽和溶液（pH 12），將配制得到的菌液分別加入不同濃度的抗菌劑應用液中。陽性對照組同樣依照此比值加入等量菌液，而陰性對照組不加菌液。用微量加樣器依次取200 μl實驗組的抗菌劑應用液，陽性對照組的菌液及陰性對照組的抗菌劑應用液至 96孔微量培養板的微孔中，共設8個復孔，置于37℃恒溫培養箱中培養48h。（3）白色念珠菌生物膜活性測定［3］：采用XTT減低法測定生物膜活性，XTT粉末用60℃預熱的0.5g/L林格液溶解，0.22μm孔徑濾器過濾除菌，分裝后-80℃冰箱保存備用。在XTT測定生物膜活性前，加入甲萘醌（以丙酮為溶劑制作1mmol/L的甲萘醌），使其濃度為1mmol/L。白色念珠菌生物膜形成條件同上，培養48h后，棄去培養基，200μl PBS洗滌3次，后每個微孔中加入100μl PBS，用微量加樣器取50μl XTT-甲萘醌混合液至每孔中，37℃避光培養2h，酶標儀測OD490nm值，每個藥物濃度均有8個孔作為重復，取平均值。（4）生物膜生物量的測定［4，5］：采用結晶紫含量測定法檢測白色念珠菌生物膜的生物量。棄去XTT-甲萘醌混合液，200μl PBS洗滌1次，自然干燥后加入結晶紫溶液100μl/孔，染色5min，后棄去結晶紫溶液，200μl PBS洗滌3次，后加入95%乙醇100μl/孔，以微量加樣器每孔連續吹吸1min至完全溶解生物膜上的結晶紫，吸取融有結晶紫乙醇轉移至另一新96孔微量培養板中，測OD560nm值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件。不同濃度抗菌劑的吸光度值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著法（LSD），檢驗水準α=0.05，P＜0.05差異有統計學意義。按以下公式計算減少率：減少率= 1-（實驗組A值-陰性對照組A值）/（陽性對照組A值-陰性對照組A值）×100%。

2 結果

2.1 不同濃度鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜活性的影響 觀察白色念珠菌生物膜形態可見48 h時形成了致密的成熟生物膜。鹽酸小檗堿可抑制白色念珠菌生物膜活性，且呈濃度相關性，隨鹽酸小檗堿濃度的升高，白色念珠菌生物膜活性降低。藥物濃度500.00mg/ L，減少率（93.8±4.2）%、250.00mg/L，（94.5±5.8）%、125.00mg/L，（91.6±3.3）%、62.50mg/L，（72.3±4.8）%、31.25mg/L，（63.7±2.5）%、15.63mg/L，（47.8±2.3）%。統計分析表明，鹽酸小檗堿在濃度為 125.00 mg/L時使白色念珠菌生物膜活性減少（91.6±3.3）%，生物膜已基本無活性。

2.2 不同濃度鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜生物量的影響 在鹽酸小檗堿的作用下，各組的白色念珠菌生物膜生物量均有所減少，且隨著鹽酸小檗堿濃度的升高，生物膜生物量逐漸減少，藥物濃度500.00 （96.3±0.6）%、250.00（95.5±1.4）%、125.00 （94.2±2.5）%、62.50（61.5±3.8）%、31.25（53.7±4.6）%、15.63（48.5±2.3）%。統計分析表明，鹽酸小檗堿濃度為125.00 mg/L時使白色念珠菌生物膜生物量減少（94.2±2.5）%。

2.3 兩種藥物對白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響 兩組作用48h后，鹽酸小檗堿濃度為125.00mg/L時對白色念珠菌生物膜具有較好的抑制作用。10%氫氧化鈣飽和溶液作用后，生物膜活性減少率及生物量減少率說明白色念珠菌生物膜對飽和氫氧化鈣溶液高度耐藥，見表1。

表1 兩種藥物對白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響±s）

表1 兩種藥物對白色念珠菌生物膜活性及生物膜生物量的影響±s）

注：與氫氧化鈣組比較，*P＜0.05

組別活性減少率生物量減少率鹽酸小檗堿組（125.00 mg/L）91.6±3.3 *94.2±2.5*氫氧化鈣組（10%飽和溶液）45.7±4.1 43.4±3.1

3 討論

白色念珠菌是形成根管生物膜的主要微生物之一。當前，抗真菌藥普遍存在毒副作用強、易產生耐藥性等原因，因此采用中藥治療越來越受到關注。本實驗所采用的鹽酸小檗堿為中藥黃連中的主要成分。有研究顯示黃連解毒湯對白色念珠菌有明顯的抑制作用［6，7］。黃連解毒湯復方由黃連等四味藥組成，每味中藥成分復雜，因此本實驗主要研究鹽酸小檗堿對白色念珠菌的抑制作用。

本實驗采用XTT 減低法檢測生物膜活性，各抗菌劑組生物膜活性的減少率總體上呈濃度相關性，說明在鹽酸小檗堿影響下，生物膜內存活細胞減少，白色念珠菌生長活力降低。本實驗表明當鹽酸小檗堿濃度升至125 mg/L時，生物膜活性降低（91.6±3.3）%，說明生物膜已基本無活性。生物膜的生物量采用結晶紫含量測定法檢測，各濃度鹽酸小檗堿的生物膜生物量都有所下降，且呈濃度相關性，說明在鹽酸小檗堿影響下，生物膜的生物量減少。白色念珠菌生物膜活性減低，生物膜的生物量減少說明鹽酸小檗堿可抑制體外白色念珠菌生物膜的形成。

實驗選用10%氫氧化鈣溶液作用于48h白色念珠菌生物膜。由于氫氧化鈣是一種較好的根管消毒藥物，可通過緩慢釋放OH-，提高組織的pH值，破壞細菌的細胞膜而殺菌。要維持較高的組織pH水平，需選用pH值高、流動性好的氫氧化鈣。10%的氫氧化鈣飽和溶液pH值超出白色念珠菌的質子泵調節范圍，可殺滅白色念珠菌，流動性好，溶液中的OH-比氫氧化鈣糊劑中的OH-更易滲透至牙本質小管深處，滲透范圍更廣［8］。鹽酸小檗堿濃度為125.00mg/L時對白色念珠菌生物膜具有較好的抑制作用，能殺滅生物膜中的大部分細菌，作用效果優于口腔臨床常用根管消毒藥物10%氫氧化鈣飽和溶液。本實驗研究結果說明鹽酸小檗堿對白色念珠菌形成具有抑制作用，由于生物膜的形成受多種基因控制，小檗堿抑制白色念珠菌形成的機制，還有待于進一步的研究。

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6 汪長中，程惠娟，官妍，等.黃連解毒湯對體外白念珠菌生物膜形成的影響.熱帶病與寄生蟲學，2007，5（2）：82～85.

7 汪長中，程惠娟，徐穎，等.黃連解毒湯及其單味藥對體外白念珠菌生物膜影響的比較.上海中醫藥雜志，2008，42（2）：63～65.

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Objective To investigate the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans biofilm formation. Methods XTT reduction assay was performed to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on Candida albicans activity. Crystal violet biofilm assay was applied to determine the effects of berberine and calcium hydroxide on the biofilm biomass. Results The reduction rate of Candida albicans biofilm activity and biomass were（91.6±3.3）% and（94.2±2.5）% respectively when the concentration of berberine was 125 mg/L. Berberine possessed better bacteriostatic ability than calcium hydroxide. Conclusion Berberine is proved to inhibit Candida albicans biofilm formation.

Berberine Calcium hydroxide Candida albicans Biofilm

·診治分析·

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