兒童下呼吸道感染流感嗜血桿菌的分離及耐藥性分析

王萍 強鑫華 周麗華

兒童下呼吸道感染流感嗜血桿菌的分離及耐藥性分析

王萍 強鑫華 周麗華

目的 測定流感嗜血桿菌（HIN）在痰標本的陽性率及藥敏分析，為臨床經驗治療HIN兒童下呼吸道感染提供實驗室的參考依據。方法 收集小兒肺炎患兒痰標本2056份，用API-NH進行菌種鑒定，嗜血桿菌和布蘭漢菌藥敏試劑盒ATB-HAEMO藥敏試驗，同時頭孢硝噻吩紙片法檢測β- 內酰胺酶。結果 2056份痰標本鏡下篩查合格標本802份，標本合格率39.01%。802份合格標出中分離到HIN257株，合格痰標本分離陽性率12.05%，產酶株占52.92%，未發現β-內酰胺酶陰性耐氨芐西林（BLNAR）和β- 內酰胺酶陽性耐阿莫西林/棒酸（BLPACR）的菌株。結論 HIN耐藥主要集中在氨基青霉素 和氯霉素及磺胺藥物上，頭孢二、三代抗菌藥物、利福平及β-內酰胺/酶抑制劑、阿奇霉素具有極佳的抗菌活性，產β- 內酰胺酶是流感嗜血桿菌對氨芐西林的主要耐藥機制。

流感嗜血桿菌 藥敏試驗 下呼吸道感染 β一內酰胺酶

除肺炎鏈球菌（SP）之外，流感嗜血桿菌（HIN）是引起兒童細菌性下呼吸道感染的常見的主要致病菌［1］，有研究表明感染流感嗜血桿菌的兒童占全部感染該菌人群的20%。隨著β-內酰胺類抗生素的普遍應用，HIN的耐藥性也受到廣泛關注。本文回顧性分析2012年1月至2014年12月下呼吸道感染兒童的臨床資料，為臨床治療提供實驗室參考依據。

1 臨床資料

1.1 菌株來源 2012年1月至2014年12月本院小兒肺炎診斷標準的住院首日患兒送檢的呼吸道痰標本中分離的HIN 257株。

1.2 方法 （1）標本采集處理及細菌鑒定：按照《微生物檢驗操作規程》（第三版）入院當天抗生素使用前一次性吸痰管負壓抽吸采集痰標本及時送檢，送檢的痰標本先行涂片鏡檢：以鱗狀上皮細胞＜10個/低倍鏡視野、白細胞＞25個/低倍鏡視野的標本作為合格標本，篩選后的合格痰標本接種于哥倫比亞血和含萬古霉素巧克力平皿，35℃，CO2孵育18～24h。巧克力平皿可疑菌落用MH平板做V、X、X+V因子需求試驗，在MH平板上V因子、x因子紙片周圍不生長，僅在V+X因子紙片周圍生長初步鑒定為HIN，再行APINH菌種鑒定。X、V、X+V紙片為英國OXOID公司產品。（2）β-內酰胺酶檢測：用Cefinase紙片（生物梅里埃公司）按說明書測定被試菌株的β-內酰胺酶。（3） 藥敏試驗：采用法國梅里埃公司生產的嗜血桿菌和布蘭漢菌藥敏試劑盒（ATB-HAEMO）進行藥敏試驗，操作嚴格按照說明書進行。質控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247。

1.3 統計學方法 藥敏試驗結果采用wHONET 5.6統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 流感嗜血桿菌陽性檢出率 2056份痰標本中，鏡下篩查合格標本802份，標本合格率39.01%。802份合格標出中分離到HIN 257株，合格痰標本分離陽性率12.50% ，高于肺炎鏈球菌在兒童呼吸道疾病的病原菌中居首位。

2.2 HIN的季節分布 HIN全年均可能導致兒童感染，春、夏、秋、冬四季分離率分別為：46.30%、13.23%、10.12%、30.35%。其中以每年2～4月份冬春交替季節間檢出率最高占51.75%，與其它季度比較差異有統計學意義。見圖1。

圖1 2012-2014年間不同月份兒童下呼吸道HIN的分離株數

2.3 β-內酰胺酶檢測結果 257株HIN共檢測到136株β-內酰胺酶陽性菌株，產酶株占52.92%。未發現BLNAR（β-內酰胺酶陰性而氨芐西林耐藥）和BLPACR（β- 內酰胺酶陽性而阿莫西林/棒酸耐藥）的HIN。

2.4 HINβ-內酰胺酶產酶株和非產酶株的藥敏結果 HIN產酶株和非產酶株的藥敏結果除氨基青霉素之外，耐藥主要集中在氯霉素和磺胺藥物上，阿莫西林/克拉維酸、頭孢呋辛、頭孢噻肟、利福平、氧氟沙星及四環素對流感嗜血桿菌均表現為高度敏感，見表2。

表2 產酶與非產酶HIN對9種抗菌藥物的藥敏結果（%）

3 討論

小兒呼吸系統發育不完善，氣管、支氣管管腔狹窄，纖毛運動差、清除能力弱，加之免疫系統發育未健全，對攜帶的HIN缺乏抵抗力，是嬰幼兒HIN引起呼吸道感染率高的原因［2］。此外，本資料顯示，不同季節呼吸道感染患兒HIN的分離率不同，以每年2～4月份冬春交替季節間檢出率最高，與地域江南春夏之交氣候變化大，易發生HIN呼吸系統疾病相關，可為流行病學調查及臨床抗感染治療提供有用信息。

HIN是“HACEK”菌群成員，屬于苛養性細菌，生長需要V X 特殊營養物質，對檢驗人員的技術水平有特定要求，加上痰標本受上呼吸道正常菌群的干擾，其分離培養較為困難，臨床上經常出現漏檢，因此，對嗜血桿菌苛氧菌的分離鑒定和藥敏試驗不僅是臨床迫切的需要，同時也是衡量微生物實驗室技術水平的重要標志［3］。

作者認為提高HIN檢出率應：（1）盡量在使用抗菌藥物前留取合格的痰標本。（2）痰涂片革蘭染色鏡檢，對標本進行培養前質量篩查，合格標本尋找WBC內吞噬的革蘭陰性球菌、球桿菌，是對病原菌進行快速診斷的簡易手段。（3）選擇適合的含萬古霉素的巧克力培養基，其富含x、V因子，且能抑制革蘭陽性球菌生長，接種后置于含5% ～10%CO2的培養箱內，箱內需保持一定的濕度。（4）對照痰格蘭染色涂片，識別可疑菌落為巧克力平皿上濕潤、1～2mm、圓形、光滑、半透明、無色至灰白色、有光澤、易乳化，散發出類似“鼠穴”氣味。菌落識別時檢驗人員的經驗非常重要，必要時，進行革蘭染色，其對確認菌落有幫助。（5）衛星試驗，血平皿衛星生長，MH上不生長或MH平板做V、X、X+V因子需求試驗，在MH平板上V因子、x因子紙片周圍不生長，僅在V+X因子紙片周圍生長是常規實驗室推薦初步篩查HIN的簡易方法［4］。HIN的痰涂片、巧克力平皿生長菌落和因子需求試驗結果。見圖1。

圖2 HIN的痰涂片（A）、巧克力平皿生長菌落（B）和因子需求試驗（C）結果

本資料結果顯示，HIN耐藥主要集中在氨基青霉素和氯霉素及磺胺藥物上。HIN對氨芐西林耐藥的主要機制主要是：（1）菌株產生質粒介導的TEM-1型或其他少見的ROB型β- 內酰胺酶，可以通過頭孢硝噻吩紙片法來檢測，若陰性氨芐西林和阿莫西林及其他β- 內酰胺類抗菌藥物敏感，若陽性則報告氨芐西林和阿莫西林耐藥。（2）產生染色體介導的菌株細胞壁上一種或多種青霉素結合蛋白PBP發生改變，引起青霉素結合蛋白與靶位親和力的降低，其次是由于外膜蛋白改變導致對氨芐西林耐藥，稱為BLNAR菌株，此時頭孢硝噻吩紙片法β- 內酰胺酶檢測陰性，無論體外藥敏結果如何，對阿莫西林/棒酸、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他巴唑、頭孢尼西、頭孢孟多、頭孢克羅、頭孢呋辛、頭孢丙烯等β- 內酰胺類抗生素均報道耐藥。本組監測中，HIN產酶株占52.92%，未發現BLNAR和BLPACR罕見菌株，顯示產TEM-I型β-內酰胺酶是HIN對氨芐西林耐藥的主要機制，與相關報道一致［5］，但產酶率有地區差異［6］。本資料結果顯示，HIN耐藥率較高的藥物除復方新諾明和氯霉素外對頭孢二、三代抗菌藥物、利福平及β-內酰胺/酶抑制劑具有極佳的抗菌活性可為臨床治療兒童感染HIN的一線藥物［7，8］，特別是阿奇霉素兼有抗非典型病原體（肺炎支原體、肺炎衣原體和軍團菌屬等）活性，以及對流感嗜血桿菌的抗菌活性，被推薦為社區獲得性肺炎及其他呼吸道感染經驗治療的首選經驗用藥，無需報告常規藥敏結果。

1 Shen，XZ，Lu，Q，Deng，L et a1.Resistance of Haemophi1us—inf1uenzae iso1ates in chi1dren under 5 years o1d with acute respira—tory infections in China between 2000 and 2002.The Journa1 of Internationa1 Medica1 Research，2007，35（4）：554.

2 胡亞美，江載芳，諸福棠，等.實用兒科學.第7版.北京：人民衛生出版社，2002：1167～1195.

3 張秀珍，朱德妹.臨床微生物檢驗問答.北京：人民衛生出版社，2008：194～200.

4 陳東科，孫常貴. 實用臨床微生物學檢驗與圖譜. 北京：人民衛生出版社，2011：469～478.

5 桂和翠，王中新，沈繼錄.48株流感嗜血桿菌耐藥性分析及B-內酰胺酶基因檢測. 安徽醫科大學學報，2012，（47）：56～59.

6 楊曉華， 譚 南，林愛心，等.兒童呼吸道流感嗜血桿菌的耐藥性分析中國感染與化療雜志. 2014（14）：436～439.

7 馬越，李景云，金少鴻，等.細菌耐藥性監測分析中應注意的問題.中國抗生素雜志，2005，30（12）：762～69.

8 程薇，錢利強，華春珍，等.兒童呼吸道標本分離的流感嗜血桿菌耐藥模式研究.檢驗醫學，2010，25（3）：192～194.

·病例報告·

313000 浙江省湖州市第一人民醫院檢驗科