煙草氨基酸代謝及其調控機制

黎旺姐， 李 勇， 崔明昆， 張 剛， 龔 明*

(1.云南師范大學生命科學學院，生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，云南昆明 650500；2.云南省煙草農業科學研究院，云南昆明 650031)

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煙草氨基酸代謝及其調控機制

黎旺姐1， 李 勇2， 崔明昆1， 張 剛1， 龔 明1*

(1.云南師范大學生命科學學院，生物能源持續開發利用教育部工程研究中心，云南省生物質能與環境生物技術重點實驗室，云南昆明 650500；2.云南省煙草農業科學研究院，云南昆明 650031)

綜述了植物氨同化以及煙草中苯丙氨酸代謝、脯氨酸代謝、美拉德反應及其與煙葉風味和品質關系的研究進展,并分析了環境因素對煙草氨基酸代謝的影響，為深入研究氨基酸對煙葉品質和風味影響的機制奠定了基礎。

氨基酸；氨同化；苯丙氨酸和脯氨酸代謝；美拉德反應；煙草

氮作為必需的最重要礦質元素之一，參與植物的生長發育、生化合成、能量轉換以及信號轉導等生理生化途徑，是促進植物生長發育和新陳代謝的重要因子。大量的氮被植物體所需要，通過合成氨基酸等途徑來形成蛋白質等生物大分子[1]。氮代謝是植物體中重要的生理過程，是植物生長發育所需的基本物質的基礎來源。近年來，生物化學、分子生物學以及其他相關學科和各種研究技術的發展使氮代謝研究取得很大發展。氨基酸是植物體內必不可少的化合物，是合成各類蛋白質的前體物質，因此，氨基酸合成及其代謝是植物生長發育中重要的生理生化過程。高等植物中，氨同化可生成氨基酸以及其他含氮化合物，是氨基酸的重要來源，此外，植物體還可直接從土壤中吸收銨鹽來合成氨基酸[2]。煙草中的氨基酸不僅是生長發育所必需的物質，也是重要的與烤煙品質與風味相關的重要物質。筆者綜述了植物硝酸鹽及銨鹽轉化為氨基酸的途徑、氨基酸與烤煙品質和風味的關系，以及幾種與烤煙風味有關的重要氨基酸的代謝及調控機制，旨在為全面深入認識氮素代謝、重要氨基酸的代謝途徑以及氨基酸與煙葉品質和風味的關系提供理論依據。

1　植物氨基酸的代謝

1.1植物氮同化土壤中的銨鹽可直接轉化為氨基酸被植物吸收，而另外一些無機氮卻需要轉化為有機氮才能被植物吸收利用[3]。銨鹽是植物氮的重要來源，另外，氨同化在植物的氮代謝過程中的意義重大[4]。植物體可通過對土壤中的氮素同化過程來吸收并利用土壤中的氮源，但是有些木本植物卻不能及時利用最初通過土壤中氮同化作用所吸收來的氮，所以會先合成蛋白并通過儲存蛋白的形式將氮源儲藏起來[5-6]。Sims等[7]通過假絲酵母試驗表明谷氨酸脫氫酶催化氨形成谷氨酸并認為此途徑是氨進入氨基酸途徑的唯一方式。植物體內的NH4+有的來自NH4+與NO3-這些離子是根通過細胞質膜上的專一性轉運子吸收而來的，另外，還有的來自植物根瘤菌的固氮作用、光呼吸作用、氨基酸代謝等[5]。氨同化途徑如圖1所示[8]。

1.2植物體內硝酸鹽和銨鹽同化為氨基酸過程中的相關酶及其調控植物體內的氮同化為氨基酸的過程中有眾多酶的參與，包括谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)、谷氨酸脫氫酶(GDH)等，這些酶在植物的不同生長發育階段含量不同，另外，不同的組織器官中含量也有所差異[3,5]。GS是氨同化的關鍵酶，在ATP存在時，NH4+和谷氨酸在GS的催化下轉化成谷氨酰胺將以無機形式存在的氮轉化為植物可以吸收利用的有機氮，作為起關鍵作用的酶參與氨同化的第1步反應，是植物氮素同化中最重要的酶之一。GS由GS基因家族來調控，GS基因的調控不僅存在于啟動子結構的特異性方面，同時還存在于轉錄水平和翻譯水平上[9-10]。GOGAT通過催化α-酮戊二酸和谷氨酰胺形成谷氨酸這個反應來影響植物氮代謝過程，且該反應是和前一個GS催化的反應偶聯成GS/GOGAT循環來調控植物氮代謝，是植物氮素代謝的主要途徑[11]。GOGAT有以還原型輔酶Ι(NADH)為輔酶定位于植物非光合組織中的NADH-GOGAT和以鐵氧還蛋白(Fd)為輔酶定位于葉綠體中的Fd-GOGAT 這2種形式，它們分別通過固定根瘤菌中的氮(豆類植物中)、氮的初吸收或者重吸收氨基酸代謝所生成的氮(NADH-GOGAT)和植物呼吸作用所生成的氨(Fd-GOGAT)來調控植物氮代謝，它們分別由GLT、GLU1,2來調控，有組織特異性和器官特異性[11-12]。GDH是植物氮循環中催化銨鹽和α-酮戊二酸生成谷氨酸的關鍵酶，它普遍存在于植物體中，各組織器官中該酶的含量有差異，特別是隨生長發育年齡的增長，作為氨的重吸收利用關鍵調控因子的GDH含量會增加，除了參與銨鹽和α-酮戊二酸反應合成谷氨酸的反應外，GDH還參與谷氨酸的氧化反應，該反應又可生成銨[13]。

圖1　植物體內硝酸鹽和銨鹽同化為氨基酸的主要途徑[9]Fig.1　Main pathways in which nitrate and ammonium are assimilated to amino acids in plants

2　煙草中脯氨酸和苯丙氨酸的代謝及其與煙葉風味的關系

氨基酸是煙草重要化合物之一，很大程度上影響著煙葉的品質與風味[14-16]，是煙草致香物質的間接前體，某些氨基酸(如苯丙氨酸)可通過反應來自身直接分解為一些諸如苯甲醇、苯乙醇等致香前體物質[17-19]。氨基酸通過脫羧或醛轉氨產生某些不參與合成蛋白質的氨基酸、芥子油、生物堿、胺類化合物以及氰苷等，其中占生物堿總含量超過90%的煙堿是煙草重要活性物質[20-21]。鳥氨酸以及精氨酸脫羧反應是煙堿合成的起始步驟，在鳥氨酸脫羧酶或者精氨酸酶的參與下，鳥氨酸以及精氨酸脫羧并合成腐胺，再經過一系列的催化反應最終生成煙堿，煙堿可刺激大腦產生興奮，烤煙中的煙堿含量是評價煙草品質好壞的重要指標之一[20-22]。

2.1煙草中苯丙氨酸代謝

2.1.1苯丙氨酸代謝途徑。苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，是煙草致香化合物苯甲醇、苯乙醇的前體[19]。作為植物代謝中最重要的次生代謝之一，在細胞中通過苯丙氨酸代謝途徑來直接或間接生成含苯丙烷骨架的物質，超過20%的代謝均會通過該途徑[23]。苯丙氨酸的合成首先是通過莽草酸途徑，由磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸經3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸合酶催化下形成分支酸，又經分支酸變位酶催化先生成預苯酸，再經脫水、脫羧反應進一步生成苯丙酮酸，經轉氨酶的作用，苯丙酮酸與谷氨酸通過轉氨作用最終生成苯丙氨酸，苯丙氨酸合成及去路如圖2所示[24]。苯丙氨酸代謝途徑是多酚類物質、生物堿等次生代謝物的通用途徑，是這些次生代謝物合成都需要經過的途徑。在苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、多酚氧化酶(PPO)等酶的催化下經過一系列反應形成某些酚類化合物的中間產物(如咖啡酸、阿魏酸、芥子酸等)，這些酚類中間產物在4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)以及其他酶的共同作用下進一步反應生成CoA酯或者香豆素、綠原酸、莨菪亭等物質。CoA酯在肉桂醇脫氫酶(CAD)以及香豆醇輔酶A降解酶(CCR)等酶的作用下生成對香豆醇、芥子醇、松柏醇等木質素單體，這些木質素單體再經過氧化物酶(POD)或漆酶氧化最終形成木質素，此外，CoA酯還可經一系列反應形成各種黃酮類物質[25-26]。

2.1.2苯丙氨酸代謝的調控。芳香族氨基酸(包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)不能在動物中合成，但在植物或者微生物中卻可以合成，其中DAHP合成酶作為第1個限速酶催化PEP和E4P生成DAHP并由此進入芳香氨基酸合成途徑，再經轉氨酶作用進入苯丙氨酸途徑[24]。在苯丙氨酸代謝途徑中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙氨酸代謝途徑中的限速酶，它催化苯丙氨酸代謝途徑中首步反應，且廣泛存在于植物中[23,27]。PAL可將苯丙氨酸催化成反式肉桂酸，還可促進香豆素、木質素、生物堿及黃酮等次生物質的生成[28]。PAL含量在不同的植物以及物種中不同，另外，不同植物器官組織中所含的PAL也不同[29]。水分、溫度等生長環境的不同PAL的含量也會有所變化，PAL是一個四聚體，含4個亞基，沒有一個特定的米氏常數[29]。不同組織中都有PAL的同工酶，是一個多基因家族，且不同成員的表達都有特異性，各不相同[30-31]。PAL表達受復雜的調控，包括生長發育的環境因子、產物的反饋調節、組織的特異性等，除此之外，PAL基因表達還會受病原菌、乙烯、機械傷害等因素的影響，在應對這些刺激時，PAL分別使用不同的轉錄起始位點來應對不同的刺激[32-33]。

苯丙氨酸代謝途徑中，C4H是繼PAL后的最重要的關鍵酶，它催化該途徑中的第1個氧化反應，在氧以及還原型輔酶Ⅱ(即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADPH)的存在下行駛功能并將反式肉桂酸催化生成對-香豆酸，從此進入下游代謝途徑[27]。不同植物中所含有的C4H基因拷貝數是有差異的，C4H酶可通過不同的催化活性中心殘基(I109、K113、V118等)、不同的肽鏈的化學修飾、不同的空間構象、不同的磷酸化位點來調控C4H酶的活性[34]。

圖2　苯丙氨酸合成途徑和去路Fig.2　Phenylalanine metabolic pathways in plants

2.1.3苯丙氨酸代謝與煙葉風味的關系。苯丙氨酸是煙葉致香前提物質，通過苯丙氨酸途徑合成的多酚類化合物在多酚氧化酶的催化下可發生氧化反應并生成醌類物質，也可通過多酚及其氧化物發生棕色化反應從而得到類黑素等物質，這些物質對煙葉顏色有重要影響[35]。除了影響煙葉色澤，多酚類物質還會影響煙草制品的香氣和吃味并呈正相關，多酚也可通過降解來產生一些可使煙草制品擁有優雅的香氣的化合物，并且可增加烤煙制品中香氣量的物質，從而影響煙葉品質[35]。生物堿中的煙堿(即尼古丁)含量越高，煙葉的香吃味評價也越高，煙堿含量和香氣濃度呈正相關，但如果含量太高則會使雜氣升高，進而余味就會變差，所以在煙草制品中煙堿含量不能太高[36]。

諸多環境因子會影響苯丙氨酸代謝，溫度是調節植物代謝的重要因素，對苯丙氨酸代謝也有很大影響。云南師范大學研究表明，溫度對苯丙氨酸代謝下游的多酚代謝有一定影響。特別是對低溫的響應很明顯[25,37]。另外，光照(包括光質、光強以及日照時間)、水分、氮素水平等因素都對苯丙氨酸代謝有重要影響。

2.2脯氨酸非酶棕化反應及對煙草品質的影響

2.2.1非酶棕化反應對煙草品質的影響。20世紀初法國著名科學家C.C.Maillard把甘氨酸和葡萄糖混在一起，然后進行加熱，則形成了褐色物質(類黑精)，從此發現了美拉德反應，也稱非酶棕化反應，該反應是指還原糖與氨基酸經過縮合、脫水、降解、聚合等一系列反應生成類黑素的過程[38-40]。后來隨著在食品中的應用，美拉德反應被定義為羰基化合物和氨基化合物(氨基酸、肽類化合物和蛋白質)所發生的復雜反應[41]。在日常食品貯藏和加工過程中，美拉德反應被廣泛應用，用于煙草可使煙草香氣更加優美、口味醇和宜人[39]。在煙草上，美拉德反應一般發生在烘烤及加工過程中，美拉德反應可生成優美的天然香氣，隨著人民生活水平的提高，對香煙的口感、香氣等舒適度的要求也越來越高，同時，在煙草行業的降焦減害的要求也越來越高，煙草工業中通過美拉德反應產生多種重要的煙草風味前提物質，卷煙中0.5%～2.0%是美拉德反應的重量，其產物與煙的香味相互協調在一起，可修飾并圓潤煙氣，因此，美拉德反應產物在煙草制品的增香領域中的研究也越來越受重視[40,42-44]。同時，美拉德反應產物通過熱裂解可產生諸如煙氣中使尼古丁的含量增加的嘧啶、氨基類化合物等堿性化合物，修飾并增加煙香，增加煙民的勁頭和滿足感，進而煙民會減少吸煙量，符合降焦減害的要求[45]。

反應溫度和pH是影響美拉德反應的重要外界條件，一般來說，溫度升高可加快美拉德反應速率，在適宜pH條件下pH升高會加快美拉德反應速率，pH太高則會降低美拉德反應速率[46]。有研究表明，滿足反應條件溫度105 ℃、時間4 h、pH10、乙醇體積分數為40%時，美拉德反應可有效增加煙草香氣[47]。

2.2.2煙草脯氨酸代謝及其抗滲透脅迫的重要作用和對煙葉品質的影響。脯氨酸是蛋白質的一個結構組成部分,是貯存氮的化合物, 是植物正常發育過程中重要的物質[48]。另外，脯氨酸是烤煙中含量最多的氨基酸之一，在煙草根、莖、葉、花等器官中都含有脯氨酸，同時它是極易溶于水的氨基酸，也是一種小分子滲透調節物質，脯氨酸可穩定細胞的亞細胞結構并清除自由基，是滲透調節物質，所以通過積累它可有效應對滲透脅迫的惡劣環境，在受干旱、高鹽等滲透逆境脅迫下會在植物體內大量積累，可穩定蛋白質的結構、調節細胞的滲透勢，在解除滲透脅迫后，脯氨酸可以為植物提供碳氮源[49-51]。另外，通過與糖類(果糖、還原糖、葡萄糖等)發生美拉德反應而生成的產物在烤煙風味中有重要貢獻[47,52-53]。

脯氨酸的生物合成途徑最早在大腸桿菌中被發現，植物中，以谷氨酸(Glu)為底物以及以鳥氨酸(Orn)為底物來合成脯氨酸是得到脯氨酸的2個途徑,其中吡咯啉-5-羧酸催化合成酶(P5CS)、△1-二氫吡咯-5-羧酸還原酶(P5CR)是谷氨酸合成途徑中的限速和調節酶，ATP存在時，在谷氨酸激酶的催化下，首先得到γ-谷氨酰磷酸，接著由L-谷氨酸-γ-半醛(GSA)脫氫酶催化反應并生成L-谷氨酸-γ-半醛，后在△1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)作用下發生自環化并形成△1-二氫吡咯-5-羧酸，接著經△1-二氫吡咯-5-羧酸還原酶(P5CR)作用最終生成脯氨酸，是高等植物中合成脯氨酸的主要途徑；δ-氨基轉移酶(δ-OAT)是調節鳥氨酸代謝途徑的限速酶，而ProDH主要負責脯氨酸的降解，是該途徑的限速酶，主要負責脯氨酸的降解[49-50,54-55]。植物中脯氨酸通過以谷氨酸為起始底物的谷氨酸途徑和以鳥氨酸為底物的鳥氨酸途徑來合成，氮源不足時主要通過谷氨酸途徑來合成脯氨酸，在具有有足夠的氮源時，合成主要通過鳥氨酸途徑來完成[56-57]。植物脯氨酸合成及去路如圖3所示[58]。

注：GSA.谷氨酰半縮醛; P5C.Δ1-吡咯啉-5-羧酸; P5CS.Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶; OAT.鳥氨酸轉氨酶; ProDH.脯氨酸脫氫酶; P5CR. Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶; GDH.谷氨酸脫氫酶; P5CDH.吡咯琳-5-羧酸脫氫酶。Note: GSA.glutamic-γ-semialdehyde; P5C.Δ1-pyrroline-5-carboxylate; P5CS.Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase; OAT.ornithine aminotransferase; ProDH.proline dehydrogenase; P5CR.Δ1-pyrroline-5-carboxylate reductase; GDH.glutamate dehydrogenase; P5CDH.pyrroline-5-carboxylate dehydragenase.圖3　植物脯氨酸合成及去路Fig.3　Proline metabolic pathways in plants

脯氨酸的含量占烤煙和香料煙中氨基酸含量的比例很大，是含量最多的氨基酸之一，對煙葉品質的貢獻主要也是通過與糖類物質的美拉德反應。有研究表明，果糖和脯氨酸通過非酶棕化反應可使煙草香氣增加，同時使雜氣和刺激性降低，在生產中，可通過改變反應條件來滿足所需的增香效果，要達到對烤煙制品的增香效果，可使果糖與脯氨酸比例為2∶1(重量比)，100 ℃下反應2 h，該反應條件是最適反應條件[52]；另外，當山梨糖與脯氨酸為1∶3(糖氨摩爾比)，pH為6的條件下，于160 ℃下反應5 h所得到的非酶棕化產物對卷煙增加香吃味有很好的效果[40]。

3　環境因素對煙草氨基酸代謝的影響

在煙草中，氨基酸是重要的物質，它不僅是煙株中蛋白質的基本單位，還可以在烤煙調制過程中生成具有揮發性的羰基化合物，有些氨基酸還是煙草中重要的致香物質的前體[19,21]。煙草中的游離氨基酸在不同烤煙品種中含量并不相同，另外，各種環境因子的影響也會導致煙葉中氨基酸含量有差異[59]。煙株在不同的生長發育過程中，氮代謝、煙株衰老過程等均可影響氨基酸的含量[60-61]。有研究表明，在香料煙中，旺長部位含有較高的總游離氨基酸和谷氨酸，這對煙株的生長、抵抗不良環境和抗病都有積極作用[62]。在受到水分缺乏或鹽分過高或者其他的滲透脅迫時，脯氨酸在煙葉中的含量會明顯增加[63]。在嚴格控制施肥等因素時，脯氨酸主要受后期加工中調制方式的影響[59]。另外，打頂方式和砍收時期也會影響氨基酸的含量，其中絲氨酸含量隨著砍收時期增長而增加，而蘇氨酸則相反[59]。肥料作為重要因素，可影響煙株生長發育，其中氮肥是影響煙株生長發育的關鍵肥料，合理施用氮肥可以得到優質的煙葉，還可提高產量，不同施肥量對紅花大金元的各生長指標有重要影響，肥量過低或過高都會影響煙草生長發育，使煙株發育不良[64]。

綜上所述，氨基酸是構成蛋白質的基本單位，也是生物體內重要生物活性分子。游離氨基酸是煙葉中的重要化合物，很大程度上影響著煙葉的品質和風味，其含量和種類受到煙草生長發育階段及外界環境條件的調控，其機制有待進一步深入研究。

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Amino Acid Metabolism and Its Regulation Mechanism in Tobacco Plants

LI Wang-jie1, LI Yong2, CUI Ming-kun1, GONG Ming1*et al

(1.Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energyof Ministry of Education,Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province, School of Life Sciences, Yunnan Normal University,Kunming, Yunnan 650500; 2.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan 650031)

The research advances on ammonia assimilation,phenylalanine and proline metabolism, maillard reaction and their relations to quality and flavour of tobacco leave were reviewed, effects of environmental factors on amino acid metabolism were analyzed, which will lay a foundation for deep analysis of effects of amino acids on tobacco quality and flavor.

Amino acids; Ammonia assimilation; Proline and phenylalanine metabolism; Maillard reaction; Tobacco

國家自然科學基金項目(31260064，31460059)；國家煙草專賣局科技專項[110201101003(TS-03)]。

黎旺姐(1990- )，女，云南普洱人，碩士研究生，研究方向：植物逆境生物學。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事植物逆境生物學研究。

2016-06-03

S 572

A

0517-6611(2016)21-015-05