高速逆流色譜分離純化雪白睡蓮花中的酚類(lèi)成分

買(mǎi)吾拉江·阿不都熱衣木，李晨陽(yáng)，李 倩，徐 芳，吉騰飛，趙 軍*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830004；3，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性成分與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

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高速逆流色譜分離純化雪白睡蓮花中的酚類(lèi)成分

買(mǎi)吾拉江·阿不都熱衣木1，李晨陽(yáng)2，李 倩1，徐 芳2，吉騰飛3，趙 軍2*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830004；3，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性成分與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

[目的] 采用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化雪白睡蓮花中的酚類(lèi)成分。[方法] HSCCC分離過(guò)程分為兩步，分別采用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)兩個(gè)體系，固定相均采用上相，流動(dòng)相均采用下相，流速為2.0 mL/min，主機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為850 r/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)純度。[結(jié)果] 第一步從200 mg 的睡蓮花提取物中分離得到異槲皮苷(I，41.4 mg)、紫云英苷(II，40 mg)和一混合物85 mg；第二步從混合物中分離純化得到isostrictiniin(III，50.1 mg)和煙花苷(IV，26.3 mg)，上述4種物質(zhì)的純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。[結(jié)論] HSCCC可快速的分離純化雪白睡蓮花中的酚類(lèi)成分。

雪白睡蓮花；高速逆流色譜；酚類(lèi)成分

雪白睡蓮花為睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾，主要分布于我國(guó)新疆的伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)。該植物為維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神之功效，在臨床上主要用于熱癥引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等病癥的治療[1]，收載于《中華人民共和國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》等醫(yī)藥文獻(xiàn)中[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，睡蓮屬植物具有抗氧化、抗肝炎、降血壓、降血糖等多種生物活性[3-5]。煙花苷等酚類(lèi)化合物是該屬植物的主要特征性成分[6]。然而目前為止對(duì)睡蓮花中該類(lèi)成分的快速分離卻鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，為了該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其相關(guān)對(duì)照品的研究，需要建立有效成分快速高效的分離純化方法。高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC)具有分離速度快、樣品損失小的特點(diǎn)，是近年來(lái)廣泛用于天然有效成分分離純化的色譜技術(shù)[7-10]。筆者在前期研究基礎(chǔ)上運(yùn)用HSCCC方法從200 mg雪白睡蓮花提取物中分離得到了4種化合物，分別為異槲皮苷(圖1 I，41.4 mg)、紫云英苷(圖1 II，40mg)、isostrictiniin(圖1 III，50.1 mg)和煙花苷(圖1 IV，26.3 mg)，其純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%，旨在為睡蓮花質(zhì)量控制方法的建立提供依據(jù)。

圖1　睡蓮花中酚類(lèi)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1　Chemical structures of phenolic compounds from Nymphaea candida

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材。雪白睡蓮花藥材購(gòu)自新疆維吾爾藥業(yè)有限公司，由新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為雪白睡蓮花(NymphaeacandidaPresl)的干燥花蕾。

1.1.2試劑。異槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和煙花苷對(duì)照品由該研究室自制，含量均大于95%。D101大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津興南允能高分子技術(shù)有限公司；聚酰胺樹(shù)脂購(gòu)自浙江臺(tái)州四甲生化材料廠(chǎng)；乙腈、甲醇為色譜純，乙醇等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器。TBE-300B高速逆流色譜儀由上海同田生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)；N2000色譜工作站由浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司生產(chǎn)；SPD-10Avp高效液相色譜儀由日本島津公司生產(chǎn)；AS系列超聲波清洗機(jī)由天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1睡蓮花提取物的制備。睡蓮花藥材脫脂后，以料液比1∶25(g/mL)加入70%乙醇，回流提取3次，每次提取0.5 h，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至浸膏。然后將睡蓮花提取物浸膏以適量蒸餾水溶解后上D101大孔樹(shù)脂，先分別用5倍柱體積的水和30%乙醇除雜，再以50%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至浸膏。浸膏以水混懸溶解后上聚酰胺吸附樹(shù)脂，先以5倍柱體積水除雜，再用60%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，干燥備用。

1.2.2HSCCC溶劑體系的確定。選擇乙酸乙酯∶水(5∶5)、乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)、乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶乙醇∶水(4∶1∶5)作為進(jìn)行HSCCC的溶劑體系。各溶劑體系配制后充分振搖，然后靜置分層，分別取上、下相溶劑各3.0 mL，置于裝有5 mg樣品的具塞試管中，充分振搖溶解后靜置分層，分別取上下相溶液以HPLC檢測(cè)，計(jì)算分配系數(shù)K，K=A1/A2(A1和A2分別為上相和下相各色譜峰的峰面積)。

1.2.3HSCCC法分離純化睡蓮花提取物中的有效成分。試驗(yàn)前將達(dá)到平衡的兩相溶劑系統(tǒng)按上相和下相分別放入試劑瓶中，超聲脫氣20 min。將上相(固定相)以10 mL/min的速度泵入HSCCC螺旋管中，待螺旋管充滿(mǎn)后，緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)至850 r/min，同時(shí)以2.0 mL/min的速度將下相(流動(dòng)相)泵入其中，待兩相平衡后取樣品200 mg溶于上下相各5 mL的混合溶液中，由進(jìn)樣閥注入到螺旋管中，同時(shí)開(kāi)始采集數(shù)據(jù)。

1.2.4HPLC檢測(cè)分析。采用HPLC檢測(cè)各色譜峰的純度。色譜條件：Phenomenex C18柱(250×4.6，5 μm)，梯度洗脫程序(0 min～15 min～20 min，21%A～25%A～21%A)；流動(dòng)相為乙腈(A)∶0.2%磷酸水溶液(B)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇溶劑系統(tǒng)的選擇是通過(guò)目標(biāo)成分的分配系數(shù)K、分離度等因素決定的，目標(biāo)成分在不同溶劑體系中的K值見(jiàn)表1。在4種溶劑系統(tǒng)中，各化合物的K值差異較大，能夠保證各化合物間具有較好的分離度。然而，在溶劑系統(tǒng)①和③中，化合物I和II的K值太大，分離時(shí)間長(zhǎng)，效率低。乙酸乙酯-甲醇-水(4∶1∶5，②)和乙酸乙酯-乙醇-水(4∶1∶5，④)系統(tǒng)有合適的K值，對(duì)分離純化睡蓮花酚類(lèi)成分較為合適，然而溶劑系統(tǒng)④在HSCCC上的保留率低，故選擇乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)系統(tǒng)進(jìn)行睡蓮花酚類(lèi)成分的分離，分別得到組分I( 41.4 mg)、II(40 mg)以及III和IV的混合物(85 mg)。溶劑系統(tǒng)③對(duì)化合物III和IV有較好的分離度，進(jìn)一步選擇該體系從該混合物中分離純化得到化合物III(50.1 mg)和IV(26.3 mg)。該體系分離效果好，固定相保留率43.1%。HSCCC分離純化效果見(jiàn)圖2。

表1　睡蓮花酚類(lèi)成分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)

注：a.乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)；b.乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)。Note: a.Ethyl acetate ∶ methanol ∶ water(4∶1∶5);b. Ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5).圖2　睡蓮花酚類(lèi)成分的高速逆流色譜Fig.2　HSCCC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

2.2HPLC純度檢測(cè)及結(jié)構(gòu)確證經(jīng)HPLC分析，化合物I、II～I(xiàn)V的純度分別為73.53%、92.42%、82.36%和85.65%。通過(guò)波譜技術(shù)及理化性質(zhì)，并與已知對(duì)照品共薄層，Rf值一致，故確證它們的結(jié)構(gòu)分別為異槲皮苷(I)、紫云英苷(II)、isostrictiniin(III)和煙花苷(IV)。

注：I .異槲皮苷，II.紫云英苷，III.isostrictiniin，IV.煙花苷。Note：I.Isoquercitrin；II.Astragalin；III.Isostrictiniin；IV.Nicotiflorin.圖3　睡蓮花酚類(lèi)成分的HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatogram of phenolic compounds from N.candida

3　結(jié)論

利用HSCCC方法對(duì)雪白睡蓮花提取物中的標(biāo)識(shí)性酚類(lèi)化合物進(jìn)行了分離純化，經(jīng)過(guò)溶劑體系的優(yōu)化選擇，應(yīng)用乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶1∶5)和乙酸乙酯∶正丁醇∶水(4∶1∶5)兩步從雪白睡蓮花提取物中分離得到了異槲皮苷、紫云英苷、isostrictiniin和煙花苷。該方法樣品損失小，且能夠快速?gòu)乃徎ㄖ蝎@得高純度的標(biāo)示性成分。試驗(yàn)結(jié)果可為維吾爾藥睡蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及其進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部中國(guó)藥典委員會(huì).維吾爾藥分冊(cè)[S].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：41.

[2] 劉勇民.維吾爾藥志：下[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：541.

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Isolation and Purification of Phenolic Compounds fromNymphaeacandidaPresl by High-speed Counter-current Chromatography

ABUDUREYIMU Maiwylajiang1, LI Chen-yang2, LI Qian1, ZHAO Jun2*et al

(1. College of Life Sciences & Technology, Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046; 2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines, Xinjiang Institute of Materia Medica, Urumqi, Xinjiang 830004)

[Objective] To isolate and purify phenolic constituents fromNymphaeacandidaPresl by high-speed counter-current chromatography (HSCCC). [Methods] HSCCC was employed to separate phenolic compounds fromN.candidawith two steps. Two solvent systems were ethyl acetate ∶ methanol ∶ water (4∶1∶5) and ethyl acetate ∶ n-butanol ∶ water (4∶1∶5). HSCCC was executed under the conditions of 2.0 mL/min flow rate, 850 r/min rotation speed and 254 nm detection wavelength. The purities of compounds were determined by HPLC. [Result] In the first separation step, isoquercitrin (I, 41.4 mg), astragalin (II, 40 mg) and mixtures of III and IV (85 mg) were extracted from 200 mg sample. In the second step, mixtures of III and IV were obtained: isostrictiniin (III, 50.1 mg) and nicotiflorin(IV, 26.3 mg). The purities of these compounds were determined as 73.53%, 92.42%, 82.36% and 85.65% by HPLC. [Conclusion] Phenolic compounds fromN.candidacan be quickly isolated and purified by HSCCC.

High-speed counter-current chromatography;Nymphaeacandida; Phenolic compounds

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20133318)。

買(mǎi)吾拉江·阿不都熱衣木(1992- )，男，新疆柯坪人，碩士研究生，研究方向：藥食兼用植物的研究與開(kāi)發(fā)。*通訊作者，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事藥食兼用植物的研究與開(kāi)發(fā)工作。

2016-06-06

S 567.2

A

0517-6611(2016)21-107-03