SIRT3通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老的研究*

宋春麗，黃　榮，李澤華，周義文△

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院：1.臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心；2.燒傷整形科，廣東深圳 518100 )

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SIRT3通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老的研究*

宋春麗1，黃榮1，李澤華2，周義文1△

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院：1.臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心；2.燒傷整形科，廣東深圳 518100 )

目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)對肝癌細胞老化的作用，并初步研究其作用機制。方法通過轉(zhuǎn)染SIRT3基因，使其在肝癌細胞內(nèi)過表達。用實時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)驗證SIRT3基因的過表達效果；BrdU標記實驗檢測它對肝癌細胞增殖的影響；β-半乳糖苷酶染色檢測肝癌細胞的老化情況；Western blot檢測它對衰老相關(guān)基因Rb、p16、P53蛋白表達的影響。結(jié)果SIRT3過表達質(zhì)粒使肝癌細胞中SIRT3的mRNA及蛋白水平明顯增加。SIRT3基因的過表達能抑制肝癌細胞的增殖，抑制率為40%～50%；同時，SIRT3基因過表達能顯著誘導(dǎo)肝癌細胞G2期周期阻滯：轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1質(zhì)粒的對照組細胞處于G2期比例為(22.83±1.58)%，而轉(zhuǎn)染SIRT3基因的實驗組處于G2期細胞為(35.65±1.55)%；SIRT3基因過表達使肝癌細胞中衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色較對照組顯著增高，陽性細胞占40%～50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并伴隨衰老相關(guān)基因Rb、p16蛋白表達水平明顯增加。結(jié)論SIRT3基因過表達可能通過Rb/p16途徑促進肝癌細胞衰老。

沉默信息調(diào)節(jié)因子3；肝細胞癌；細胞衰老

肝細胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的90%[1]。HCC起病隱匿,出現(xiàn)典型臨床癥狀時大多已處于中晚期,失去手術(shù)機會,自然生存期不超過半年[2]。sirtuin家族是一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶[3]，包括SIRT1～SIRT7,沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)是線粒體內(nèi)主要的去乙酰化酶，一般存在于線粒體基質(zhì)中，在成熟過程中它的N末端在線粒體基質(zhì)容易被水解。只有被切割的SIRT3蛋白才具有活性，當SIRT3信號肽被切除以后，它使組蛋白去乙酰基化從而發(fā)揮其活性。SIRT3作為一種線粒體蛋白，主要在以下方面發(fā)揮著重要作用，如細胞凋亡[4]、物質(zhì)代謝[5]、細胞老化[6]、能量產(chǎn)生[7]和細胞內(nèi)信號控制等[8]。近年來SIRT3在腫瘤中的作用日益受到人們的關(guān)注，但其在HCC中發(fā)生、發(fā)展過程中的機制還不完全清楚。本研究通過將過表達SIRT3基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于肝癌細胞中，檢測SIRT3基因過表達對肝癌細胞老化的作用，并初步探討其作用機制，以尋求其對肝癌基因治療的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器熒光定量PCR儀、Western blot 電泳儀、Western blot 電轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-rad公司，Mastercycler96孔普通PCR儀、5810R臺式高速低溫離心機購自美國Eppendorf公司，酶標儀購自美國Gene Company Limited公司。

1.1.2試劑人肝癌細胞株SK-Hep-1購自ATCC公司，SIRT3質(zhì)粒(載體為pc-DNA3.1)、pc-DNA3.1質(zhì)粒購自Addgene公司。Brdu ELISA試劑盒購自羅氏公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，SIRT3抗體(#2627)、P16抗體(#4824)、P53抗體(#2527)、Rb抗體(#9313)、β-actin 抗體(#4970) 購自CST公司，二抗購自瑞典GE healthcare公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國伯樂公司，LightCycler?FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Roche 12239264001購自羅氏公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將SK-Hep-1肝癌細胞株在含有1%青/鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱，于5% CO2的環(huán)境中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測SIRT3基因過表達的mRNA水平提取細胞中的RNA，用30 μL去RNA酶的水將RNA溶解，測濃度,電泳檢測RNA提取質(zhì)量，純度合格后構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：1 000 ng RNA，5×反應(yīng)混合液4 μL，iScript酶混合液1 μL，去RNA酶水補齊至20 μL。充分混勻后按以下條件反應(yīng):25 ℃ 5min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。構(gòu)建10 μL qPCR體系:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，去RNA酶水3.6 μL，SYBR Green qPCR Mix(2×)5 μL，SIRT3上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 2 min;變性94 ℃ 20 s,退火60 ℃ 20 s,延伸72 ℃ 20 s,隨后75 ℃ 1 s,34個循環(huán),從第2個循環(huán)開始讀數(shù)，溶解曲線為55～95 ℃,每次波動1 ℃,保持2 s。SIRT3引物序列，F(xiàn)：5′-ATCGATGGGCTTGAGAGAGT-3′；R：5′-AGGTTCCATGAGCTTCAACC-3′。所有測試管均采用三管重復(fù)，并重復(fù)實驗3次，取其平均值。

1.2.3Western blot檢測SIRT3基因過表達的蛋白水平種SK-Hep-1細胞(每孔8×104)于6孔板中，24 h后將表達SIRT3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進SK-Hep-1細胞中，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，然后裂解細胞進行Western blot檢測。

1.2.4BrdU標記法檢測肝癌細胞增殖SK-Hep-1細胞以25×104/mL細胞數(shù)接種于6孔板中24 h分別轉(zhuǎn)染了pc-DNA3.1、SIRT3,第2天再以6 000/每孔的細胞數(shù)分至96孔板培養(yǎng)2 d，終止細胞培養(yǎng)前，加入BrdU(終濃度為30 μg/L)，37 ℃ 6 h，用FixDenat37溶液固定細胞30 min，加抗BrdU單抗(工作濃度1∶100)，陰性對照孔加磷酸鹽緩沖液(PBS，室溫，90 min)，酶標儀讀取的OD值跟細胞內(nèi)DNA的合成速率呈正比。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞周期將表達SIRT3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進SK-Hep-1細胞中，以pc-DNA3.1作為空白對照，96 h后收集細胞，應(yīng)用5 mL的PBS洗滌收集的細胞3次，離心沉淀細胞，棄上清液，70%預(yù)冷的乙醇-20 ℃過夜固定，離心固定過的細胞，棄上清液，PBS洗滌細胞3次用來除去殘留的乙醇，用含有0.2 mg RNase A的1 mL PI/Triton X-100染色液(20 μg PI/0.1% Triton X-100)重懸細胞，37 ℃染色15 min。上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6衰老因子相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色將生長狀態(tài)良好的SK-Hep-1細胞接種至6孔板中，24 h后分別轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1、SIRT3質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染4 d后加入X-Gal底物，進行跟衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞數(shù)，隨機選擇3個視野進行觀察，每個視野計數(shù)200個細胞，計算β-半乳糖苷酶染色陽性的細胞占總細胞數(shù)的百分比。

1.2.7Western blot分析衰老相關(guān)蛋白提取肝癌細胞中的蛋白，BCA法檢測樣本蛋白水平，取蛋白總量為30 μg的樣品，加入對應(yīng)體積的 6×SDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液(含β巰基乙醇)，95 ℃ 10 min使蛋白變性，在含有8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的凝膠中120 V恒壓電泳1.5 h，然后90 V恒壓轉(zhuǎn)膜4 h，將NC膜轉(zhuǎn)至5%脫脂牛奶中封閉，搖床上室溫1 h，TBST洗滌后分別加入用5%BSA稀釋的一抗中(SIRT3抗體的工作濃度1∶3 000，P16抗體、P53抗體、Rb抗體的工作濃度均為1∶1 500)，搖床，4 ℃過夜，1×TBST洗滌3次，將NC膜置于用5%脫脂牛奶稀釋用HRP標記的二抗(工作濃度1∶3 000)中，搖床，室溫2 h后，1×TBST洗滌3次，5 min 1次，然后將NC膜置在暗盒中ECL顯影曝光。

2　結(jié)　　果

2.1qPCR檢測SIRT3的過表達效果將SIRT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細胞，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，轉(zhuǎn)染72 h后提取細胞總RNA。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了SIRT3質(zhì)粒的肝癌細胞mRNA水平較對照組明顯增加，說明SIRT3基因的過表達是成功的。見圖1。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3；aP<0.05。

2.2Western blot檢測SIRT3基因過表達的蛋白水平將SIRT3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細胞，同時以pc-DNA3.1作為空白對照，轉(zhuǎn)染72 h后提取細胞蛋白裂解液進行Western blot檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了SIRT3質(zhì)粒的肝癌細胞中SIRT3基因的蛋白水平較對照組明顯增加，說明SIRT3的蛋白水平也成功地過表達，見圖2。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3。

2.4SIRT3基因過表達對細胞周期的影響將pc-DNA3.1、SIRT3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-Hep1細胞，轉(zhuǎn)染96 h后固定細胞進行流式細胞術(shù)分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT3的細胞處于G2期細胞較對照組細胞(pc-DNA3.1組)明顯增加(P<0.05)，說明SIRT3基因過表達會誘使細胞產(chǎn)生G2期細胞周期阻滯。見圖3和表1。

注：1為pc-DNA3.1；2為SIRT3；aP<0.05。

表1　　流式細胞術(shù)檢測細胞周期(%)

注：與pc-DNA3.1組比較，aP<0.05。

注：1為pc-DNA3.1;2為SIRT3；aP<0.05。

2.5SIRT3基因過表達誘導(dǎo)肝癌細胞衰老在光學(xué)顯微鏡下觀察到變成藍色的表達β-半乳糖苷酶的細胞數(shù)較對照細胞明顯增多；在SK-Hep1細胞中，轉(zhuǎn)染SIRT3質(zhì)粒的細胞的染色陽性細胞數(shù)比對照細胞多近3倍，以上結(jié)果說明SIRT3過表達誘導(dǎo)肝癌細胞老化。見圖4。

2.6SIRT3基因過表達促進衰老相關(guān)蛋白Rb、p16和p53的表達Western blot結(jié)果顯示在SK-Hep-1細胞中，SIRT3基因過表達使SK-Hep1細胞中Rb蛋白和p16蛋白的表達量明顯增多，而p53蛋白的表達量卻沒有明顯變化。Rb可以通過誘導(dǎo)p16的表達從而引起細胞周期阻滯，從而在細胞衰老中起關(guān)鍵作用。提示SIRT3過表達可能通過調(diào)控Rb/p16途徑誘導(dǎo)了細胞衰老。見圖5。

圖5　　　　　Western blot分析轉(zhuǎn)染SIRT3質(zhì)粒96 h后的細胞中Rb、p16和p53蛋白水平

3　討　　論

近年來，SIRT3在腫瘤發(fā)生、凋亡及調(diào)控中的作用越來越受到人們的關(guān)注。SIRT3可以通過調(diào)節(jié)KU70-Bax通路參與細胞凋亡[9]，通過去乙酰化SOD2、MnSOD來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)[10-11]，通過調(diào)節(jié)p53途徑來誘導(dǎo)老化等[7]。SIRT3在一些腫瘤中也起著雙重調(diào)節(jié)的作用，比如它在口腔癌中表達上調(diào)，對口腔癌起促進腫瘤發(fā)生的作用[12]，而在乳腺癌[13]、骨肉瘤[14]、結(jié)腸癌[15]中表達降低，對腫瘤起抑制作用。SIRT3在肝癌中的作用及機制，目前國內(nèi)外這方面的報道很少。本研究通過前期大量HCC標本的篩查,發(fā)現(xiàn)SIRT3在人HCC組織中的表達明顯低于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)SIRT3在多個肝癌細胞系中也呈現(xiàn)低表達狀態(tài)[16]。在本研究發(fā)現(xiàn)SIRT3過表達可使肝癌細胞受到明顯抑制，引起細胞周期G2期細胞阻滯，并使與老化相關(guān)的β-半乳糖苷酶明顯增加，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)部分老化相關(guān)基因(Rb、p16)的蛋白表達水平均明顯增加，而p53蛋白表達卻沒有明顯變化，從而得出 IRT3基因的過表達可能通過Rb/p16途徑,而不是p53/p21途徑促進肝癌細胞衰老從而抑制細胞的增殖。筆者前期報道過SIRT1基因沉默后引起細胞周期G1期細胞阻滯，衰老相關(guān)基因p53和p21蛋白表達增加，可能通過p53/p21途徑促進細胞衰老[17]。說明SIRT1和SIRT3雖同屬于sirtuin家族，但在肝癌細胞衰老中的作用路徑和調(diào)控機制卻有明顯差異，甚至發(fā)揮相反的作用，特別是其作用在細胞內(nèi)的信號通路也會有明顯不同，進一步加深了研究者對sirtuin家族了解的興趣。

細胞衰老是引起生物體老化的一種潛在因素，也被認為是生物體抑制腫瘤的一種方式。目前研究報道普遍認為端粒長度的縮短是觸發(fā)細胞老化的關(guān)鍵因素[18-19]。本課題計劃下一步將合成Rb和p16 siRNA，觀察Rb和p16基因干擾后是否逆轉(zhuǎn)SIRT3過表達引起的部分老化，以提供更充分的證據(jù)確定它是否通過Rb/p16途徑引起肝癌細胞的衰老，并通過qPCR篩查端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和保護端粒蛋白復(fù)合體(包括TRF1和POT1等)以及其他的端粒相關(guān)蛋白，希望通過對SIRT3在HCC中的功能鑒定和研究，加深對肝癌細胞老化機制的認識，為尋找新的肝癌治療靶點打下基礎(chǔ)。

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Study on the SIRT3 inducing senescence in hepatocelluar carcinoma cells through the Rb/p16 pathway*

SONGChunli1,HUANGRong1,LIZehua2,ZHOUYiwen1△

(1.CenterforClinicalLaboratoryMedicine,ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518100,China;2.BurnandPlasticSurgeryDepartment,ShenzhenHospitalofSouthernMedicalUniversity,Shenzhen,Guangdong518100,China)

ObjectiveTo study the effect of SIRT3 gene(SIRT3) on aging of hepatocellular carcinoma cells(HCC) and it's mechanism.MethodsSIRT3 over-expression was targeted by plasmid transfected technology.Effect of SIRT3 on aging of HCC was detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Proliferation of HCC was assayed by Brdu-labeling test.Cell cycle of HCC was displayed by flow cytometry.Aging of HCC was observed with SA-β-gal staining.Aging-related Rb,p16,P53 proteins were demonstrated by Western blot.ResultsSIRT3 over-expression significantly upregulated the SIRT3 mRNA and protein expression levels in HCC.SIRT3 suppressed the proliferation of HCC with an suppression rate of 40%-50%,and significantly induced cell cycle arrest of HCC at stage G2.The proportion of pc-DNA3.1,SIRT3 plasmid transfected HCC at stage G2was about (22.83±1.58)% and (35.65±1.55)%.The aging-related β-galactosidase-stained HCC were significantly greater with a positive rate of 40%-50%(P<0.05),and the aging-related Rb,p16 protein expression levels were significantly higher.ConclusionSIRT3 promotes the aging of HCC possibly through the Rb/p16 pathway.

SIRT3;hepatocellular carcinoma;cell aging

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項目(A2016568)；廣東省深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研基金(201601043)。

宋春麗，女，主管技師，主要從事分子生物學(xué)研究。△

，E-mail:yiwenzhou21@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.006

A

1673-4130(2016)16-2220-04

2016-06-23

2016-07-29)