SSA/Ro60自身抗原的基因克隆與表達純化*

牛廣華，張　程，呂　丹，高玉潔

(遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032)

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SSA/Ro60自身抗原的基因克隆與表達純化*

牛廣華，張程△，呂丹，高玉潔

(遼寧中醫藥大學附屬醫院，沈陽 110032)

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表達純化，為輔助診斷自身免疫提供物質基礎。方法采用RT-PCR技術擴增SSA/Ro60基因，定向插入pPICZ表達載體，轉入畢赤酵母表達系統，將獲得的重組蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鑒定。結果擴增出約1.5 kb的SSA/Ro60全長序列，獲得相對分子質量60×103的重組蛋白，經鑒定具有SSA/Ro60抗原性。結論成功克隆并表達SSA/Ro60，為診斷自身免疫疾病奠定基礎。

SSA/Ro60;基因克隆;表達純化

干燥綜合征(SS)是一種全身外分泌腺的慢性炎性自身免疫反應疾病。研究表明，干燥綜合征A型抗原(SSA)與SS、系統性紅斑狼瘡(SLE)等疾病的發生、發展及預后判斷密切相關[1]。SSA抗原是細胞質中一類小核糖核酸與蛋白質結合的復合物,是一種重要的自身抗原[2]。近年來越來越多的學者對自身免疫性疾病進行深入的研究，對Ro抗原的認識也越來越深，Ro成為了核糖核蛋白復合物(RNP)抗原中最常見的抗原之一[3]。后來發現，Ro抗原與SSA屬同一種自身抗原，故命名SSA/Ro抗原[4]。同時有研究者發現檢測SSA/Ro抗原在臨床上對自身免疫性疾病的診斷有極其重要的意義[5]。該抗原有52 000和60 000兩種相對分子質量的蛋白，分別稱為SSA/Ro52和SSA/Ro60。SSA/Ro60存在于多種自身免疫性疾病患者體內,生理狀態下SSA/Ro60核蛋白及hYRNA共同構成核糖核蛋白復合體SSA/Ro60抗原，與多種自身免疫疾病密切相關[6]。目前檢測SSA的免疫雙擴散法無法區分Ro52和Ro60，免疫印跡法只能檢出Ro52，常常導致Ro60的漏檢[5]。所以本實驗應用基因克隆技術成功表達出SSA/Ro60，為下一步建立新的SSA/Ro60檢測方法奠定基礎。

1　材料與方法

1.1質粒、菌株、細胞株PMD18-T質粒、人白血病HL-60細胞株購買自TAKARA公司，pPICZ質粒、大腸埃希菌DH5α、酵母菌SMD1168由大連大學實驗室贈送。

1.2儀器與試劑Thermo Hera生物安全柜；Biorad C1000 PCR擴增儀；Biorad穩壓穩流水平電泳儀；Biorad穩壓穩流垂直電泳儀；Thermo Heracell 150 CO2細胞培養箱；Thermo Maxq 6000恒溫培養搖床；BIO-RAD凝膠成像分析系統；BIORAD電穿孔儀；電轉化杯。PCR試劑盒、 DNA連接酶試劑盒、限制性內切酶、切膠純化試劑盒、質粒抽提純化試劑盒均購買自TAKARA公司。cDNA合成試劑盒來自Transgen Biotech。抗SSA抗體、生物素標記的羊抗鼠IgG、親和素標記的HRP購買自ABCAM公司。

1.3方法

1.3.1SSA基因的擴增HL-60細胞株經CO2細胞培養箱培養收獲，用TRIZOL方法提取RNA后反轉錄成cDNA。利用GeneBank數據庫確定SSA在基因組的位置，設計其兩端的引物，并引入限制性內切酶位點，HIS標簽位點等為后續的克隆及蛋白純化提供便利。上游引物：SAP3 5′-CCG GAA TTC AAA AGA ATG GAG GAA TCT GTA AAC CAA ATG CAG CCA CTG AAT GAG AAG CAG ATA-3′，下游引物：SAP4 5′-GCC TCG AGT TAT CAT TAT CAA TGA TGA TGA TGA TGA TGG GAA CCA CCA CCA CCT TAA ATC ATA TCT AAT GTG AAA TTT CGA ATT ACA T-3′。反應條件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s共30個循環， 72 ℃ 10 min。擴增片段應為1 511 bp。

1.3.2PCR產物純化，TA克隆及測序將PCR產物切膠純化后測量濃度，經合適的酶切后連接于PMD18-T載體構建重組質粒，通過藍白斑篩選方法，挑出白色斑點的重組質粒進行LB培養，培養后送至上海生工測序。

1.3.3定向克隆將測序鑒定好的質粒和PICZ質粒進行雙酶切，經切膠純化后按合適濃度進行定向連接，轉化至DH5α后過夜培養，提取質粒，酶切鑒定。

1.3.4重組子線性化、導入表達系統及篩選挑選正確的轉化菌,增殖后抽提質粒,用SacⅠ行單酶切,生成線性pPICZ-SSA重組子。采用電穿孔方法,將線性重組子導入畢赤酵母菌SMD1168中。用G418篩選高表達重組菌。

1.3.5重組蛋白的SDS-PAGE電泳分析在上述重組菌上清液1 mL加入0.4 g無菌的硫酸銨充分混勻,4 ℃條件下放置2 h,期間約10 min混勻一次,在4 ℃條件下,15 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入15 μL pH 7.4 PBS徹底混勻,再加入上樣緩沖液15 μL混勻,置100 ℃煮沸5 min(Marker煮1 min),然后4 ℃,15 000 r/min離心5 min。取25 μL樣品加樣后進行電泳(4 ℃,120 V),考馬斯亮藍染色。

1.3.6重組蛋白的Western blotting鑒定利用電轉儀將重組蛋白轉至PVDF膜上，BSA-TBST為封閉液，一抗是鼠抗人SSA抗體，二抗是生物素標記的羊抗鼠IgG抗體，在親和素標記的HRP、TMB顯色液共同作用下完成。

1.3.7蛋白純化將離心過濾后的碎菌上清液加入準備好的His Bind column柱中，經過一系列的洗柱平衡后收集濾液。

2　結　　果

2.1SSA基因擴增及SSA-TA克隆測序瓊脂糖凝膠電泳結果顯示約一條1.5 kb的特異性條帶,片段大小與預計的1 511 bp相符(圖1)。且重組質粒測序結果顯示與GeneBank報道的一致。

注：1為SSA PCR產物；M為DL2000 Marker。

2.2SSA-PICZ雙酶切鑒定將SSA-PICZ重組質粒用XhoⅠ與EcoRⅠ雙酶切后電泳鑒定，得到兩條清晰條帶，片段大小分別為3.6 kbp和1.5 kbp，與預期結果一致(圖2方框內)。

注：方框內為雙酶切后基因片段，上面約3.6 kb為質粒，下面約1.5 kb為SSA;最右側為DL2000 Marker。

2.3重組蛋白SDS-PAGE和Western blotting鑒定本實驗成功表達出SSA/Ro60重組蛋白，經SDS-PAGE電泳分析，在60 000左右的位置出現一條較濃的蛋白區帶(圖3)。且該重組蛋白可與鼠抗人SSA結合，WB實驗中可被特異性抗體識別，顯示其有良好的特異性(圖4)。

圖3　　重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

圖4　　重組蛋白Western blotting圖譜

3　討　　論

Ro抗原根據其蛋白成分相對分子質量的大小分為兩種類型:Ro52和Ro60抗原[7]。Ro抗原大部分存在于細胞質內,少部分存在于核周質及核內。Ro抗原在細胞內以低含量的RNP形式存在,是與細胞角蛋白相似的一種纖維網絡,所以對該抗原的提取具有一定的難度[8]。

由于自身抗原本身的特點為低含量、種類多,所以提取自身抗原的難度較大，要獲得均一的自身抗原更為困難。本實驗從人白血病淋巴細胞HL-60株提取RNA,通過反轉錄技術得到cDNA,再以cDNA為模板成功擴增出了SSA基因。將SSA基因轉入pPICZ載體構建pPICZ-SSA重組質粒,并將重組質粒導入畢赤酵母菌SMD1168真核表達系統進行誘導表達,最終獲得純度較高的重組蛋白，經過對重組蛋白的純化鑒定后，證明其有一定的特異性。

本實驗對靶基因SSA/Ro60 的核苷酸序列進行 cDNA 合成中,采取反轉錄PCR 這一途徑代替用合成寡核苷酸探針篩選 cDNA 文庫的繁瑣基因克隆途徑，可以方便、簡捷地合成出目的基因SSA/Ro60。

畢赤酵母真核表達系統是蛋白表達研究中比較常用的表達系統。與原核表達系統相比,畢赤酵母基因系統具有許多優點[9-12]。(1)具有強大的啟動子：畢赤酵母載體具有最強的醇氧化酶基因啟動子，使得該表達系統對外源蛋白表達的調控相當嚴格。(2)表達量高：宿主菌株在畢赤酵母

菌中易于進行高密度連續發酵培養,外源蛋白表達量高。(3)穩定性高:重組質粒能在畢赤酵母體系中的特定位點以單/多拷貝的形式穩定整合,使外源基因在宿主細胞中穩定存在。

重組SSA/Ro60 抗原能特異識別患者體內抗SSA血清,因而可用重組抗原作為診斷抗原來檢測自身免疫病,也可分析其片段的抗原性以了解其抗原表位，為探索自身免疫病的發生、發展提供輔助依據。下一步的研究中,筆者將對重組蛋白進行理化學分析，希望通過對SSA/Ro60重組抗原的透徹分析,從分子免疫學角度為某些自身免疫病的臨床診斷提供依據，為制備重組抗原用于臨床檢測奠定基礎。

[1]蔡逸婷，劉慶中，趙超，等.聯合檢測抗α-胞襯蛋白、抗SSA和抗SSB抗體在干燥綜合征診斷中的應用[J].現代免疫學，2012，32(2)：152-155.

[2]彭勇， 譚立明，李華，等.ANA、SSA、SSB、RO-52在干燥綜合征診斷中的臨床意義 [J].實驗與檢驗醫學，2013，31(3)：229-247.

[3]鄭宗富.SSA抗原的克隆表達及其抗體檢測方法的建立[D].福州：福建醫科大學學報，2007.

[4]魏權，楊湘越，蘭小鵬．人自身抗原SSA/Ro60的基因克隆和原核表達[J]．實用醫技雜志，2005，12(23)：3393-3394．

[5]徐泉.60kd SSA/Ro抗原的提取、純化及蛋白質組學鑒定[D].北京：中國協和醫科大學，2004.

[6]李潔.抗SSA/RO60kDa抗原表位特異性單克隆抗體的表達和致病機制的研究[D].北京：中國協和醫科大學，2009.

[7]呂良敬，陳順樂， 顧越英，等.R060/SSA基因轉染HEp-2細胞作為間接免疫熒光檢測底物及其應用[J].標記免疫分析與臨床，2006，13(1)：31-34.

[8]朱濤.人自身抗原Ro52的酵母重組表達及其抗體檢測斑點免疫金滲濾法的建立[D].福州：福建醫科大學，2011.

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Gene cloning and expression purification of human autoimmune antigen SSA/60*

NIUGuanghua,ZHANGCheng△,LYUDan,GAOYujie

(AffiliatedHospitalofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang,Liaoning110032,China)

ObjectiveTo clone human autoimmune antigen SSA/Ro60 and to purify its expression to provide the material basis for the assisted diagnosis of human autoimmune diseases.MethodsThe SSA/Ro60 gene was cloned by RT-PCR and directionally inserted into expression vector pPICZ.The recombinant plasmid was transformed into Pichia SMD1168.The obtained recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.ResultsThe amplified full-length sequence was about 1.5 kb in size.The pPICZ-SSA positive clone produced a 60×103recombinant protein which had natural immunogenicity of human autoimmune antigen SSA/Ro60 by SDS-PAGE and Western blot.ConclusionHuman autoimmune antigen SSA/Ro60 is successfully cloned and expressed,which lays a foundation for diagnosing autoimmune diseases.

SSA/60；gene cloning；expression and purification

遼寧省自然科學基金資助項目(02014010058-301)。

牛廣華，男，主任技師，主要研究方向是風濕免疫分子生物。△

，E-mail:cecillia-85414@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.007

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1673-4130(2016)16-2224-03

2016-01-29

2016-06-03)