臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型別多樣性分析

楊永長，陳　亮，肖代雯，喻　華，劉　華，黃文芳

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610072)

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臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec型別多樣性分析

楊永長，陳亮，肖代雯，喻華，劉華，黃文芳△

(四川省醫學科學院/四川省人民醫院檢驗科，成都 610072)

目的探討臨床分離耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)SCCmec型別。方法收集臨床分離并經全自動微生物鑒定系統準確鑒定的表皮葡萄球菌84株，通過PCR擴增esp和mecA基因準確鑒定MRSE，采用多重PCR對MRSE SCCmec進行分型，分析其分布特點。結果PCR擴增結果顯示，84株臨床分離表皮葡萄球菌均可擴增出esp基因，mecA檢出率為76.19%(64/84)，其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物MRSE檢出率分別為76.8%、68.8%、100.0%和71.4%。多重PCR擴增結果顯示，64株MRSE中，SCCmec單一型別為22株，其中SCCmecⅠ型19株、SCCmec Ⅲ型3株；SCCmec混合型為42株，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株，Ⅰ、Ⅲ混合型14株，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株，Ⅱ、Ⅲ混合型5株，Ⅲ、Ⅳ混合型9株。結論臨床分離的MRSE SCCmec型別存在明顯的多樣性，以混合SCCmec型別為主。

耐甲氧西林表皮葡萄球菌；SCCmec型別；MRSE；多樣性

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)的檢出率越來越高，已成為全世界醫院感染的重要病原菌[1]。我國一項細菌耐藥監測結果顯示，82.9%的臨床分離表皮葡萄球菌對甲氧西林耐藥[2]。攜帶mecA基因是甲氧西林耐藥的主要機制，該基因位于新型的可移動元件SCCmec基因盒上，目前已發現多種SCCmec基因型，其中SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型為醫院獲得性，SCCmecⅣ、Ⅴ型為社區獲得性。研究發現，凝固酶陰性的甲氧西林耐藥葡萄球菌中SCCmec型別具有明顯的多樣性[3-5]，可能同時含有1～3種SCCmec型別，以及其他新的SCCmec類型[6-8]。本文通過多重PCR檢測臨床分離MRSE的SCCmec型別，進一步分析SCCmec型別的特點，為深入探討MRSE的分子特征奠定基礎。

1　材料與方法

1.1菌株來源84株表皮葡萄球菌為2012年3月至2013年3月本院門診及住院患者分離的無重復菌株，所有菌株采用全自動微生物鑒定系統鑒定，其中血液分離56株，痰液分離16株，中段尿液分離5株，傷口分泌物分離7株。

1.2儀器與試劑PCR 反應試劑、100 bp DNA Ladder 購自北京康為世紀，PCR 擴增儀購自美國Bio-Rad公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自美國Savant公司，凝膠成像系統購自美國Bio-Rad 公司。esp、mecA和SCCmec分型的引物由上海英俊公司合成。

1.3檢測方法

1.3.1細菌收集與DNA提取復蘇低溫保存的表皮葡萄球菌，接種至血平板，37 ℃ 5% CO2培養24 h，收集細菌，按文獻[9]提取表皮葡萄球菌DNA。

1.3.2PCR擴增esp基因按照文獻[10]的方法擴增esp基因，根據凝膠電泳結果判斷臨床分離菌株是否為表皮葡萄球菌。

1.3.3PCR擴增mecA基因按照文獻[10]的方法擴增mecA基因，依據凝膠電泳結果區分MRSE和甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)。

1.3.4多重PCR對MRSE SCCmec分型按照文獻[11]合成引物，采用多重PCR擴增MRSE菌株SCCmec基因盒上8個位點確定其型別。

1.4統計學處理采用Excel2007軟件進行數據處理及統計學分析。

2　結　　果

2.1PCR擴增esp基因鑒定表皮葡萄球菌PCR擴增結果顯示，所有臨床分離菌株均可擴增出244 bp的esp基因片段，表明這些菌株都是表皮葡萄球菌。

2.2PCR擴增mecA基因區分MSSE和MRSE臨床分離的84株表皮葡萄球菌中，mecA擴增陽性64株(76.19%)，mecA陰性20株，其中血液、痰液、尿液和傷口分泌物MRSE檢出率分別為76.8%、68.8%、100.0%和71.4%，提示不同來源分離的表皮葡萄球菌均以MRSE為主。

2.3臨床分離MRSE SCCmec分型結果多重PCR擴增結果顯示，64株MRSE中，SCCmec單一型別為22株(34.38%)，其中 SCCmecⅠ型19株(29.69%)，SCCmec Ⅲ型3株(4.69%)。SCCmec混合型為42株(65.62%)，其中Ⅰ、Ⅱ混合型2株(3.13%)，Ⅰ、Ⅲ混合型14株(21.88%)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型12株(18.75%)，Ⅱ、Ⅲ混合型5株(7.81%)，Ⅲ、Ⅳ混合型9株(14.06%)。部分菌株的多重PCR凝膠電泳結果見圖1。

注：泳道1～7為臨床分離MRSE SCCmec；M為100 bp DNA Ladder。

3　討　　論

SCCmec是葡萄球菌屬所特有的一種遺傳結構，至今未發現在其他菌種含有該元件，它主要由mec基因復合體、盒式染色體重組酶基因(ccr)和無功能J區組成，根據mec和ccr可將SCCmec分為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ。目前，MRSA的SCCmec分型研究比較成熟，而耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)中SCCmec的研究則相對較少，且所攜帶的SCCmec也相對比較復雜，研究中不斷發現新的型別和亞型。因此，研究SCCmec型別對了解MRCNS的分子特征具有重要意義。

由于地域和抗菌藥物使用習慣的不同，各國流行的MRCNS菌株存在一定的差異，美國主要以SCCmecⅣ型MRSE為主[12]，而巴西醫源性MRCNS主要攜帶SCCmecⅠ、Ⅲ型[13]。芬蘭一家醫療單位分離出的61 例MRCNS中，49 例(80%)為MRSE，SCCmec類型分布具有多樣性：20例(33%)Ⅳ型,11例(18%)Ⅴ型,4例(6%)Ⅰ型,3例(4%)Ⅱ型,還有23例(38%)是新類型[14]。國內有關MRCNS研究顯示SCCmec型別也具有明顯的多樣性[5]。本研究應用Oliveira法對64株MRSE的SCCmec分型顯示，SCCmecⅠ型占29.69%，SCCmec Ⅲ型占4.69%，SCCmec混合型占65.62%(包括3.13%的Ⅰ、Ⅱ混合型，21.88%的Ⅰ、Ⅲ混合型，18.75%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型，7.81%的Ⅱ、Ⅲ混合型，14.06%的Ⅲ、Ⅳ混合型)，大量混合型SCCmec菌株的出現反映了MRSE中SCCmec型別的多樣性。

目前世界各地不斷有新的SCCmec基因型被報道。愛爾蘭學者發現在MRSA中存在SCCmecⅠ-pls型(不含pls)、SCCmecⅢ-pI258/Tn554型(不含pI258/Tn554)和SCCmec Ⅳ-dcs型(無dcs區)等變異體[15]。我國學者在海南省分離的MRSA中檢測出包括缺少dcs區的Ⅰ型、缺少dcs區但包含mecⅠ區的Ⅰ型等7種SCCmec新型別[16]。本文研究結果顯示MRSE中混合型SCCmec占絕大多數，筆者推測可能是由于SCCmec基因變異率高，自身不斷地發生突變、插入、缺失或重組，使某些菌株不能用現有方法進行分型。

本研究利用多重PCR發現，臨床分離的MRSE SCCmec具有明顯的多樣性，主要以混合型SCCmec為主，為進一步了解MRSE的分子特征奠定了基礎。

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Diversity of SCCmec type diversity in clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis

YANGYongchang,CHENLiang,XIAODaiwen,YUHua,LIUHua,HUANGWenfang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanProvincialAcademyofMedicalSciences/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

ObjectiveTo investigate the SCCmec types of clinically isolated methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE).MethodsEighty-four strains of clinically isolated Staphylococcus epidermidis identified by the fully automatic microbiological identification system were collected and performed the MRSE identification by PCR for amplifying esp and mecA genes and SCCmec typing.Its distribution characteristics were analyzed.ResultsEsp gene was amplified in 84 strains and the detection rate of mecA was 76.19% (64/84),in which the MRSE detection rates in blood,sputum,urine and wound secretion were 76.8%，68.8%，100% and 71.4% respectively.The multiple PCR amplification displayed that among 64 strains of MRSE,19 strains were SCCmec simple type,in which 19 strains were SCCmec type Ⅰ and 3 strains were SCCmec type Ⅲ;42 strains were SCCmec mixed type,in which 2 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅱ,14 strains were SCCmec mixed type Ⅰ and Ⅲ,12 strains were SCCmec mixed type Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ,5 strains were SCCmec mixed type Ⅱ and Ⅲ,a strains were and SCCmec mixed type Ⅲ and Ⅳ.ConclusionThe SCCmec type in clinically isolated MRSE shows obvious diversity and its majority is SCCmec mixed type.

methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis;SCCmec type；MRSE；diversity

楊永長，男，主管技師，主要從事臨床微生物研究。△

,E-mail：huangwf2002@21cn.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.026

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1673-4130(2016)16-2273-03

2016-01-24

2016-03-29)