直接免疫熒光法檢測兒童呼吸道病毒抗原的結(jié)果分析

楊　泉，席金甌

(湖北省婦幼保健院檢驗科，武漢 430000)

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直接免疫熒光法檢測兒童呼吸道病毒抗原的結(jié)果分析

楊泉，席金甌△

(湖北省婦幼保健院檢驗科，武漢 430000)

目的評價直接免疫熒光法對兒童呼吸道病毒抗原的診斷價值，并探討兒童呼吸道病毒的流行特征。方法用直接免疫熒光法檢測6 282例住院兒童呼吸道分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒A型(FLUA)，流感病毒B(FLUB)，副流感病毒1型(PIV1)，副流感病毒2型(PIV2),副流感病毒3型(PIV3)和腺病毒(ADV)7種呼吸道病毒。結(jié)果6 282例標本中病毒陽性檢出835例，總陽性率13.29%；其中RSV最高，陽性率8.83%；其次是PIV3，陽性率2.80%；冬季發(fā)病較高，夏季最少。0～6個月的幼兒發(fā)病率較高。結(jié)論直接免疫熒光法簡單、快速，可用于兒童呼吸道病毒感染的早期診斷。

呼吸道感染；兒童；呼吸道病毒；直接免疫熒光

呼吸道病毒感染是常見感染性疾病，目前證明大部分是由病毒感染引起，呼吸道病毒感染以空氣或飛沫形式傳播。病毒種類繁多，癥狀相似，臨床上很難鑒別[1]，因此快速鑒別呼吸道病毒抗原對兒童呼吸道感染的早期診斷、治療和預(yù)后有十分重要的意義。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014年1～12月在湖北省婦幼保健院兒科住院的呼吸道感染患兒共6 282例，其中男3 451例、女2 831例，年齡0～12歲。春季1 651例，夏季1 289例，秋季1 544例，冬季1 798例。0～6個月1 342例，>6個月至1歲1 621例，>1～3歲1 852例，>3歲1 467例。

1.2儀器與試劑熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)，檢測試劑盒由美國的Diagnostic Huybrids.INC公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1標本采集使用無菌的8#嬰兒輸液軟管收集鼻咽抽吸液，該軟管與一次性的抽吸液采集管和抽液裝置相連接，在患者處于仰臥體位時，將1～2 mL生理鹽水注入患者鼻腔然后吸出。抽吸液和灌洗液應(yīng)用等體積的運輸培養(yǎng)基在裝有無菌玻璃珠的離心管中稀釋。

1.3.2細胞涂片制備劇烈漩渦標本10～15 s，(400～600)×g離心5～10 min，收集上清液并將其另置，用于病毒分離，加入5 mL的1×PBS，劇烈渦旋10～15 s，(400～600)×g離心5～10 min，并棄去上清液，重復(fù)數(shù)次，將沉淀加入0.5～1 mL的1×PBS液，劇烈渦旋15 s后在8孔的玻片上每孔分別加入25 μL標本懸浮液，將這些孔完全風(fēng)干，冷丙酮固定。

1.3.3直接標本檢測分別加一滴各種呼吸道病毒的熒光試劑于8孔對應(yīng)的孔中，留一孔作為陰性，對于呼吸道抗原對照玻片分別加入一滴各種呼吸道病毒的熒光試劑于已標示的對應(yīng)孔中，一起進行直接免疫熒光檢測。

1.4原理采用熒光素直接標記的針對呼吸道病毒的特異性單克隆抗體，對呼吸道病毒進行快速檢測和鑒定。該試劑盒包括1瓶呼吸道病毒熒光試劑，含有FITC標記的分別針對呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、副流感病毒1～3型(PIV 1、2、3)、流感病毒A型(FLUA)、流感病毒B型(FLUB)的單克隆抗體混合物。另有分別含有針對相應(yīng)病毒的單克隆抗體，該試劑盒可直接對標本或細胞進行檢測。用于檢測的細胞來自于臨床標本，用丙酮固定載體上，呼吸道病毒熒光試劑被加于其上以檢測是否有呼吸道病毒抗原存在。在35～37 ℃孵育后，用洗滌液進行洗滌，然后加上封固液，用蓋玻片覆于其上。最后用熒光顯微鏡進行觀察。病毒感染的細胞被染上綠色熒光，未感染上的細胞無熒光但會染上紅色。如標本中有感染的細胞，則進一步用各種針對不同病毒的熒光試劑進行檢測，以鑒定其感染的病毒種類。如果直接對標本檢測未發(fā)現(xiàn)熒光標記的細胞并且所有細胞都被染成紅色，將標本進行細胞培養(yǎng)并用呼吸道病毒熒光試劑復(fù)檢。如果觀察到陽性結(jié)果，再按照上述步驟進行鑒定檢測，將細胞用丙酮固定于載體上，分別將各種針對不同病毒的熒光試劑加于其上，在35～37 ℃孵育后，用洗滌液進行洗滌。然后加一滴封固液，用蓋玻片覆于其上，最后用熒光顯微鏡進行觀察。病毒感染的細胞被染上綠色熒光，這樣可以確定待檢的呼吸道病毒的種類。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1病毒檢出率6 282例患兒中檢出呼吸道病毒感染835例，總陽性率為13.29%，其中RSV最高(8.83%，555/6 282)，其次PIV3(2.8%，176/6 282)、FLUA(0.7%，44/6 282)、ADV(0.35%，22/6 282)、FLUB(0.25%，16/6 282)、PIV1(0.24%，15/6 282)、PIV2(0.11%，7/6 282)。不同季節(jié)各類病原體檢出率比較見表1。冬季發(fā)病最高(19.9%)，其次是春季發(fā)病(13.45%)、秋季發(fā)病(9.84%)，夏季發(fā)病最少(7.91%)。冬、春季增高，夏、秋季降低。

2.2不同年齡各類病原體檢出率比較0～6個月發(fā)病率最高(20.86%)，其次>1～3歲(14.63%)和>6個月至1歲(13.51%)，>3歲的最低(4.43%)。見表2。

表1　　不同季節(jié)各類兒童呼吸道病毒檢測率[n(%)]

表2　　不同年齡各類兒童呼吸道病毒檢測率[n(%)]

3　討　　論

急性呼吸道病毒感染是導(dǎo)致發(fā)展中國家兒童住院及死亡的常見疾病，RSV、FLUA、FLUB、PIV1、PIV2、PIV3、ADV感染是多發(fā)急性呼吸道感染的常見原因[2]。在診斷是否有細菌引起的呼吸道感染中，病毒檢測變得越來越重要，采用熒光標記的單克隆抗體對直接抗原標本進行檢測是病毒實驗室的標準檢測方法。呼吸道感染常為季節(jié)性的，流感病毒典型的流行期為冬季和春季，ADV常發(fā)于晚冬至早夏，RSV好發(fā)于早春和冬季，PIV則在全年都有可能發(fā)生。因此進行早期快速的呼吸道病毒檢測十分重要。有研究證明呼吸道病毒抗原檢測陽性結(jié)果的患者接受抗菌藥物治療的時間明顯縮短，這樣既可以減少抗菌藥物的使用，又使住院時間縮短[3-4]。

目前診斷呼吸道病毒感染的方法較多。傳統(tǒng)方法為電鏡檢測病毒顆粒，但陽性率低，診斷時間較長，且電鏡難以在臨床實驗室普及；病毒分離培養(yǎng)過去常作為“金標準”，但費時、費力、要求高，很難常規(guī)普及；堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶(APPAAP)僑聯(lián)酶標法，操作步驟繁雜易出現(xiàn)非特異性著色，陽性結(jié)果難以判斷；血清學(xué)方法由于特異性抗體產(chǎn)生慢、滴度低。分子檢測是呼吸道病毒檢測的新標準，分子方法(如PCR技術(shù))的靈敏度比組織培養(yǎng)方法高12%～30%，但PCR技術(shù)實驗要求高，易污染[5]。尋求一種快速、簡便的檢測方法對兒童呼吸道感染的早期診斷有重要的意義。因此本研究用直接免疫熒光法檢測兒童呼吸道病毒抗原，結(jié)果顯示，病毒檢出835例，總陽性率13.29%，檢出率低于國內(nèi)外大多數(shù)地區(qū)，如廣州69.7%[6]，常州25.93%[7]，廈門42.5%[8]，可能本院是婦幼保健院病例較多的原因。其中RSV最高占總陽性8.8%，RSV是武漢地區(qū)的重要病原體，與國內(nèi)外相關(guān)報道一致。RSV是兒童下呼吸道感染最常見的病毒體,嬰幼兒最高,通常在冬春季節(jié)流行[9]。其次是PIV3占總陽性數(shù)的2.8%，ADV卻不是武漢地區(qū)的主要感染原因。冬季發(fā)病較高，RSV檢出284例(15.79%)最高，其次為FLUA檢出40例(2.24%)；夏季RSV檢出11例(0.85%)最少，PIV3檢出74例(5.74%)最高。武漢地區(qū)冬季陰冷，早晚溫差大，是兒童呼吸道病毒感染的高發(fā)季節(jié)，0～6個月的幼兒發(fā)病率較高，嬰幼兒檢測率高可能與嬰幼兒期細胞免疫功能尚未完成，氣道分泌物中缺少分泌型免疫球蛋白A(SIgA)有關(guān)，且血清中母體抗體降低，而自身產(chǎn)生的IgG水平不高有關(guān)[10]。這個階段的幼兒免疫系統(tǒng)較弱，呼吸道黏膜還沒有發(fā)育健全，較易發(fā)生感染。因此本研究用直接免疫熒光檢測兒童呼吸道病毒抗原，方法簡便、快速，為保證質(zhì)量，在每次染色時，都同時需對一片未使用過的呼吸道病毒抗原對照玻璃片進行染色，以保證結(jié)果的可靠性。該方法準確可靠，值得推廣，對兒童呼吸道感染用藥具有指導(dǎo)作用，同時能監(jiān)督并預(yù)測可能傳播的病毒亞型，以指導(dǎo)疫苗的生產(chǎn)。

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