碳青霉烯類非敏感腸桿菌的耐藥性與基因型研究

杜任生,庾永基,肖偉明

(廣州市花都區第二人民醫院檢驗科　510850)

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碳青霉烯類非敏感腸桿菌的耐藥性與基因型研究

杜任生,庾永基,肖偉明

(廣州市花都區第二人民醫院檢驗科510850)

目的研究碳青霉烯類非敏感腸桿菌的耐藥性與基因型。方法自2013年6月至2014年6月采集碳青霉烯類非敏感腸桿菌共計110株，選用K-B紙片分析細菌對藥物有無敏感性，采用改良后的Hodge試驗分析碳青霉烯細菌在臨床上的使用反應。測試菌株耐藥基因對BLAST對比(局部序列比對)與PCR、DNA進行分析測試。結果測試出替加環素中介11株和耐藥4株(黏質沙雷菌、產氣腸桿菌2株)。110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌對頭孢噻肟和阿莫西林/克拉維酸耐藥率最高，頭孢他啶、四環素、復方磺胺甲噁唑、亞胺培南、厄他培南、環丙沙星、氨曲南等耐藥率均為64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、頭孢吡肟耐藥率較低，為16.6%～40.1%；敏感率增高的為替加環素、米諾環素，分別為82．0%和86.6%。研究發現110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌當中，檢測出blaSHV-12、blaCTX-M-15、ESBLs、blaCTX-M-33等基因。在110株碳青霉烯細菌當中還檢測出1株黏質沙雷菌，基因型號為blaKPC-2;改良后的Hodge試驗77株陽性，檢出率為70%。36株(32.7%)ESBLs呈陽性，5株陰溝腸桿菌(blaIMP-26)與1株產氣腸桿菌(blaVIM-2)基因、31株大腸埃希菌。結論碳青霉烯腸桿菌的基因型主要有blaKPC-2基因、blaIMP-26基因、blaVIM-2基因。藥敏結果顯示碳青霉烯類腸桿菌科細菌對米諾環素和替加環素敏感率增高，臨床用藥時可根據患者病情進行合理選擇，以達到控制感染的效果。

碳青霉烯類抗菌藥物；耐藥性；基因型；腸桿菌

近幾年隨著科技不斷發展，臨床上應用廣譜β-內酰胺酶與Amp C酶的腸桿菌科細菌越來越廣泛，對廣譜β-內酰胺酶使用率也是不斷增加。由于臨床上經常使用碳青霉烯類抗菌藥物進行抗菌治療，隨著時間推移，造成臨床使用抗感染藥物的困難逐年上升。目前。碳青霉烯類腸桿菌被國內外學者廣泛關注[1-4]。為進一步研究碳青霉烯類腸桿菌基因型情況，采集本院感染菌株110株，分析碳青霉烯類腸桿菌抗耐藥性與基因型。

1　材料與方法

1.1菌株自2013年6月至2014年6月收集本院臨床標本當中分離的碳青霉烯類非敏感腸桿菌共110株，其中黏質沙雷菌10株、布氏檸檬酸桿菌1株、陰溝腸桿菌20株、大腸埃希菌62株、氣腸桿菌14株、奇異變形桿菌1株、摩根摩根菌2株，實驗過程中亞胺培南與厄他培南只要出現上述兩種或兩種以上細菌耐藥即為非敏感菌株。產IMP-4型酶、KPC-2型酶肺炎克雷伯菌、TEM-5型、肺炎克雷伯菌ATCC700603酶肺炎克雷伯菌、IMI-1型酶陰溝腸桿菌、SHV-3型酶。

1.2試劑與儀器血瓊脂平板、M-H肉湯、血液增菌培養基、M-H瓊脂均為杭州天微生物公司生產。PCR檢測試劑盒為北京天根公司生產。阿米卡星、環丙沙星、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶/克拉維酸、阿莫西林/克拉維酸、妥布霉素、四環素、頭孢噻肟/克拉、維酸頭孢他啶、氨曲南、亞胺培南、米諾環素、藥敏紙片頭孢吡肟、呋喃妥因、替加環素、復方磺胺甲噁唑，以上產品均為上海生工公司生產。本次使用的VITEK-33全自動微生物分析儀為SP1000 PCR擴增儀，Tanon1600凝膠成像系統以及DYY-Ⅲ電泳儀。三羥甲基氨基甲烷(Tris) 、溴化乙錠和瓊脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)使用試劑盒均由上海天能公司生產。

1.3方法

1.3.1鑒定細菌及藥敏試驗本次采用菌株經VITEK-32全自動微生物分析儀進行鑒定，根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)使用K-B紙片檢測菌株的藥物敏感性[5]。

1.3.2檢測碳青霉烯本次檢測KPC-2型酶肺炎克雷伯菌顯示為陽性對照株，按照GLSI標準進行改良的Hodge試驗。

1.3.3擴增產物測序及 DNA 序列分析本文的擴增引物根據文獻[6-8]設計,委托上海生工公司合成。本次檢測PCR擴增產物使用ABI-PRISM3730儀器進行測試，對檢測出的GenBank與BLAST數據進行分析,試劑使用配套試劑，操作過程完全按照儀器和試劑的說明書進行。

1.3.4ESBLs檢測使用2013年版CLSI推薦的紙片法表型確證試驗[5]。

2　結　　果

2.1藥敏試驗結果實驗數據顯示，本次測試出替加環素中介11株和耐藥4株(黏質沙雷菌、產氣腸桿菌2株)。本次試驗耐藥率為93.9%，顯示110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌對與頭孢噻肟和阿莫西林/克拉維酸耐藥率最高，頭孢他啶、四環素、復方磺胺甲噁唑、亞胺培南、厄他培南、環丙沙星、氨曲南等耐藥率均為64.9%～88.4%；而妥布霉素、阿米卡星、呋喃妥因、頭孢吡肟耐藥率較低，為16.6%～40.1%；敏感率增高的為替加環素、米諾環素，分別為82．0% 和 86.6%。

2.2ESBLs與MHT檢測結果本次從110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌細菌當中測出產碳青霉烯酶細菌77株(70%)、陰溝腸桿菌15株(19.5%)、黏質沙雷菌6株(7.8%)。77株產碳青霉烯酶細菌中大腸埃希菌49株(63.6%)、產氣腸桿菌5株(6.5%)。36株ESBLs細菌。數據顯示同時產ESBLs和碳青霉烯酶兩種酶的細菌為18株，占16.6%。見表1。

表1　　數據分析110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌科細菌碳青霉烯酶與ESBLs的檢出率[n(%)]

2.3耐藥酶基因檢測及序列測定結果110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌中，分別有33株(30%)、1株(0.9%)、5株(4.5%)檢出blaVIM-2、blaKPC-2、blaIMP-26等碳青霉烯酶基因；分別有9株(8.6%)、5株(4.5%)、1株(0.9%)檢測出blaCTX-M-3、blaSHV-12、blaCTX-M-15等ESBLs基因。62株大腸埃希菌中有31株(50.0%)檢出blaKPC-2基因，檢測出有8株攜帶blaSHV-12基因、1株攜帶blaCTX-M-15基因。20株陰溝腸桿菌中，有5株攜帶blaIMP-26基因、1株攜帶blaVIM-2基因、1株攜帶blaCTX-M-3基因、3株攜帶blaSHV-1基因。14株產氣腸桿菌檢出含blaKPC-2與blaSHV-12基因各1株。未從檸檬酸桿菌中檢測出GIM、SIM、GES、NDM-1、IMI、OXA、SPM等基因。除以上檢出基因還檢出10株黏質沙雷菌、1株布氏檸檬酸桿菌、2株摩根摩根菌、1株奇異變形桿菌、1株blaKPC-2陽性、blaCTX-M-15基因，以上檢測未檢出碳青霉烯酶以及ESBLs基因。詳見圖1。

注：M為DNA marker；1～5分別為blaKPC-2、blaIMP-26、blaVIM-2、blaSHV-12、blaCTX-M-15；6為陰性菌株。

3　討　　論

本次研究數據顯示110株碳青霉烯類非敏感腸桿菌中含有blaVIM-2、blaIMP-26、blaKPC-2這3種碳青霉烯酶耐藥基因,陰溝腸桿菌基因主要有blaVIM-2、blaIMP-26，實驗發現碳青霉烯類非敏感腸桿菌可產ESBLs，本次實驗發現110株菌當中有16.6%的菌株同時生產碳青霉烯酶與ESBLs，研究發現ESBLs，主要以blaCTX-M-15為主，blaSHV-12、blaCTX-M-3兩種基因為輔，主要分布于陰溝腸桿菌與產氣腸桿菌。碳青霉烯類中介或耐藥的腸桿菌科細菌以肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、黏質沙雷菌等為主，這些細菌應作為醫院感染防控的主要對象[6-7]。碳青霉烯類藥物被認為是治療腸桿菌科細菌感染較為有效的藥物，但近年來，腸桿菌科細菌對此類藥物的耐藥率在逐年增加。耐藥的主要機制是菌株產生碳青霉烯類水解酶(包括A、B和D類)，其次是 ESBLs 或頭孢菌素酶合并外膜蛋白改變和(或)外排泵作用，導致碳青霉烯類抗菌藥物敏感性下降甚至耐藥[8-9]。研究發現碳青霉烯類非敏感腸桿菌敏感率低于厄他培南以及亞胺培南，造成的原因有可能是非碳青霉烯酶引起的，造成其敏感率降低的原因還需進一步研究。藥敏結果顯示碳青霉烯類腸桿菌科細菌對米諾環素和替加環素敏感率增高，臨床用藥時可根據患者病情進行合理選擇，以達到控制感染的目的。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.054

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1673-4130(2016)16-2333-02

2016-03-05

2016-06-18)