盾殼霉抗逆性菌株的篩選

金　強，　段作營，　夏森玉，　沈志松，　李華鐘，　金　堅*

1. 江南大學藥學院， 江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學工業微生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫 214122；3. 無錫楗農生物科技有限公司， 江蘇 無錫 214122

?

盾殼霉抗逆性菌株的篩選

金強1，段作營2，夏森玉3，沈志松3，李華鐘2，金堅1*

1. 江南大學藥學院， 江蘇 無錫 214122； 2. 江南大學工業微生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫 214122；3. 無錫楗農生物科技有限公司， 江蘇 無錫 214122

通過測定野生型盾殼霉JN-CM菌株對所選的各種農藥和化肥的耐受性，確定草甘膦、吡蟲啉和磷肥對盾殼霉具有較大的抑制作用。采用紫外誘變方式分別篩選了對草甘膦、吡蟲啉和磷肥具有一定耐受性的突變菌株，分別命名為UV-G(草甘膦抗性)、UV-I(吡蟲啉抗性)和UV-P(磷肥抗性)。此3種抗性突變株具有良好的遺傳穩定性，同時在生長繁殖能力及侵染相關酶活性方面與野生菌株無明顯差異，具有良好的應用潛力。

盾殼霉； 突變菌株； 紫外誘變

菌核病是一種廣泛分布的植物真菌病害，其病原菌為核盤菌(Sclerotiniasclerotriorum)[1,2]。核盤菌在生長后期形成菌核，菌核是一種抗逆性極強的休眠結構，在條件合適的情況下會繼續萌發侵染植株，產生病害[3]。現在我國大量使用化學殺菌劑進行菌核病的防治，對生態環境，人類健康都會造成不利影響。生物防治是現階段用于植物病害的另一種有效手段，其具有專一性強、作用時間久、無致病性的特點，對于菌核病的生物防治主要是利用生防菌盾殼霉(Coniothyriumminitans)進行。

盾殼霉是核盤菌的一種重寄生菌[4]，研究表明盾殼霉可以寄生并破壞核盤菌的細胞壁，分泌的β-1-3葡聚糖酶和幾丁質酶等可以分解和利用菌核，導致細胞壁塌陷，菌核變軟，核盤菌死亡[5]。以盾殼霉為有效成分的生物農藥產品已經上市，并得到廣泛的應用。現有產品在實際應用過程中，為操作方便，節省人工成本，一般是和一定濃度的農藥和化肥聯合施用。但有些化肥和農藥會對盾殼霉的生長和侵染造成影響，從而使相互共存存在問題，篩選有關耐受性菌株是解決這一問題的有效途徑[6]。

本文主要研究所選化肥及農藥對盾殼霉孢子萌發及菌絲生長的影響，通過紫外誘變的方式篩選對化肥、農藥具有一定耐受能力的抗性菌種，并對抗性菌株的生長繁殖能力及酶學活性進行評價。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與培養基

盾殼霉菌株(C.minitans)JN-CM由無錫楗農生物科技有限公司提供；核盤菌(S.sclerotriorum)為本研究室從江蘇省句容市某發病油菜地中分離得到。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDB)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。如需要配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基，則添加瓊脂15～20 g。

明膠培養基：明膠10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

MCD培養基：NH4H2PO42.0 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g； FeSO40.01 g；1% ZnSO41 mL；0.5% CuSO41 mL，加入5 g研成粉末的菌核，定容到1 000 mL[7]。

1.1.2供試農藥及化肥

41%草甘膦(美國孟山都公司)；10% 吡蟲林(海利爾藥業集團股份有限公司)；5% 啶蟲脒(萬邦生物有限公司)；1.14% 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(山東恒豐化學有限公司)；氮肥(有效成分尿素)；磷肥(有效成分過磷酸鈣)；鉀肥(有效成分硝酸鉀)來自河北省沃豐科技有限公司。

1.2菌株培養及孢子懸液制備

(1) 平板培養及孢子懸液制備：取盾殼霉試管斜面用接種針刮取后點種在PDA平板上，或吸取孢子懸液加入到PDA平板涂布后培養。培養條件為20 ℃，10 d后用無菌水洗下菌落上的分生孢子，用雙層擦鏡紙過濾制成孢子懸液，取樣用顯微鏡鏡檢計算孢子的含量，根據使用需要稀釋到相應含量。

(2) 液體培養：取100 μL的盾殼霉孢子懸液(108CFU/mL)接種到100 mL液體培養基(PDB或MCD)，20 ℃，200 r/min振蕩培養。

1.3盾殼霉菌株生長情況測定

1.3.1菌株萌發率測定

取100 μL的孢子懸液(107CFU/mL)涂布平板，20 ℃培養36 h后，在顯微鏡下測定孢子萌發率(隨機轉動鏡頭，每個鏡頭超過30個孢子，芽管長度大于孢子直徑視為萌發，每次測量5個視野)。

1.3.2菌絲生長速度測定

取長有10 d盾殼霉菌株的PDA平板，用5 mm打孔器切取菌落邊緣的菌絲塊并接種到新的PDA平板中央，記錄第5 d和第10 d的菌落直徑，利用十字交叉法計算該平板上的菌絲生長速度[8]。

1.3.3菌體干重測定

取100 mL PDB液體培養物(20 ℃，200 r/min培養10 d)用濾紙過濾，將所得盾殼霉菌體在60 ℃烘干至恒重。

1.4農藥和化肥對盾殼霉生長的影響

1.4.1盾殼霉對農藥和化肥耐受性測定

根據所選農藥和化肥的正常使用濃度，每種制成三個不同濃度含藥平板，分別測定盾殼霉的萌發率和菌絲生長速度，以不加藥劑為空白對照。按式1計算抑制率。

(1)

A:空白對照的萌發率或菌絲生長速度；Ai：各處理的萌發率或菌絲生長速度。

1.4.2農藥和化肥對菌株最小全抑制濃度測定

每種供試藥劑都制成7個濃度的含藥平板，以不加藥劑作為對照，測定各濃度下的孢子萌發率，規定孢子萌發率最先為零的濃度即為最小全抑制濃度。

1.5菌株誘變及突變株的篩選

確定對盾殼霉生長具有較強抑制作用的農藥或化肥種類，采用紫外誘變的方式篩選對該農藥或肥料具有一定耐受性的盾殼霉突變菌株。對盾殼霉分生孢子懸浮液進行紫外誘變[9](107CFU/mL，誘變條件：15 W，30 cm，10 min)，取100 μL孢子懸液涂布PDA平板，20 ℃培養。待長出孢子后，洗下孢子涂布在加藥平板上(藥劑濃度為最小全抑制濃度)，長出單菌落時挑出并接種到PDA平板培養到長出孢子，再次洗下涂布到加藥平板上(最小全抑制濃度)，測定萌發率，萌發率80%以上即為抗性菌株。

1.6抗逆性菌株的遺傳穩定性評價

將挑選的抗性菌株接種到PDA平板上20 ℃培養15 d，制成孢子懸液再次轉接到PDA板上培養15 d，如此重復8次，取第8次的孢子懸液涂布到含藥平板(最小全抑制濃度)上。以菌株JN-CM為對照，比較各抗性株的萌發率。

1.7盾殼霉酶活的測定

1.7.1幾丁質酶活測定

采用DNS法測定還原糖生成量[10]，通過還原糖生成量比較酶活高低。以膠體幾丁質作為底物[11]，取1 mL酶液加入試管(以高溫滅活的酶液作為對照)，并加入1 mL 1%的膠體幾丁質磷酸緩沖液，50 ℃水浴10 min，加入3 mL DNS終止反應，沸水浴5 min后迅速拿出冷卻至室溫。酶活力單位定義為以每小時生成1 μmol的N-乙酰葡萄糖所需的酶量。

1.7.2β-1-3葡聚糖酶活測定

以海帶多糖為反應底物。取1 mL粗酶液加入試管(以高溫滅活的酶液作為對照)，并加入0.8 mL的醋酸緩沖液和0.2 mL的海帶多糖(50 g/mL)，50 ℃水浴10 min，加入3 mL DNS終止反應，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫。酶活力單位定義為測定條件下每分鐘分解海帶多糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.7.3蛋白酶酶活的測定

方法參見劉旭燕的論文[12]。

2　結果與討論

2.1JN-CM菌株對農藥和化肥的耐受性

2.1.1菌株在正常使用濃度下對農藥及化肥的耐受性

將所選農藥和化肥分別與PDA平板混合，按正常使用濃度(在實際種植過程中的使用濃度)配制成以下3個濃度梯度，由低到高分別設置為處理1～處理3。(1) 草甘膦(g/L)：2.5、5、7.5；(2) 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(g/L)：0.25、0.5、1；(3) 啶蟲脒(g/L)：0.25、0.375、0.5；(4) 吡蟲林(g/L)：0.5、1、1.5；(5) 氮肥、鉀肥、磷肥(g/L)：2.5、5、7.5。測定各藥劑在不同濃度下對盾殼霉JN-CM孢子萌發和菌絲生長的影響，結果如表1、2所示。從表1、2可看出，除草劑草甘膦，殺蟲劑吡蟲林對盾殼霉孢子的萌發(最大抑制率分別為98.38%和80%)和菌絲生長(最大抑制率分別為100%和41.76%)均有強烈的抑制作用；化肥與農藥不同，只有磷肥對孢子的萌發有一定影響(最大抑制率為18.35%)，只有鉀肥對菌絲生長有一定抑制(最大抑制率28.71%)。

表1　盾殼霉菌絲生長的抑制率/%

表2　盾殼霉孢子萌發的抑制率/%

2.1.2所選化肥和農藥對菌株的最小全抑制濃度

提高農藥與化肥的加藥量，制成8個濃度梯度。(1)草甘膦：0、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6(g/L);(2)吡蟲林：0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5(g/L);(3)啶蟲脒：0、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8(g/L);(4)甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽：0、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25(g/L);(5)磷肥，氮肥，鉀肥：0、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25(g/L)。提高加藥量后，各處理組的孢子萌發率變化如圖1所示。

從圖1可以看出，氮肥和鉀肥在測定濃度下對盾殼霉孢子萌發率并無較大影響，而其他各農藥和化肥的最小全抑制濃度分別為：草甘膦為6 g/L、吡蟲林為5 g/L、啶蟲脒為7.5 g/L、阿維菌素為22.5 g/L、磷肥為25 g/L。結合2.1.1的結果，除草劑草甘膦，殺蟲劑吡蟲林對盾殼霉的生長抑制作用顯著，需要篩選抗逆性菌株。磷肥在高濃度條件下也會對盾殼霉分生孢子的萌發造成顯著抑制。化肥在實際使用中，只有追肥才會采用噴灑，基肥通常直接施用于土壤，且化肥使用常出現過量施用的情況，因此盾殼霉與高濃度化肥直接接觸的概率較大，因此需要篩選對磷肥具有一定抗逆性的盾殼霉菌株。

2.2紫外誘變及JN-CM突變菌株的篩選

經過紫外誘變后，在加藥平板上挑出盾殼霉單菌落接種到PDA平板，去除生長較慢，不產孢子的菌株，每種挑選一株抗逆性菌株，分別命名為UV-G(草甘膦抗性)，UV-I(吡蟲啉抗性)，UV-P(磷肥抗性)。

2.3抗性菌株遺傳穩定性

將抗性株UV-G、UV-I和UV-P在PDA平板上連續傳代8次，然后涂布到含藥平板(最小全抑制濃度)上，測定各菌株孢子萌發率，以菌株JN-CM為對照。結果顯示，對照菌株孢子不能萌發，而各抗性株的孢子可正常萌發，且萌發率均在80%以上(數據未給出)，表明抗性可以穩定遺傳。

2.4抗性株和對照株JN-CM的比較

2.4.1菌絲生長情況及菌絲干重的比較

測定菌株UV-G、UV-I、UV-P和JN-CM在無選擇壓力條件下的生長速率和菌絲干重。如圖2所示，菌株UV-P菌絲生長最快，UV-I則比對照株生長的慢。在菌絲干重方面，各菌株間差別不大。這說明在無選擇壓力條件下，各抗性菌株生長能力與對照株JN-CM相比無明顯差異。

圖1　各農藥和化肥的最小全抑制濃度

2.4.2孢子萌發率的比較

取各抗逆性菌株的孢子懸液100 μL(106CFU/mL)涂布PDA平板，測定24 h、36 h和48 h的孢子萌發率，以菌株JN-CM作為對照。結果如圖3所示，雖然在萌發初期(24 h)，JN-CM的孢子萌發率要高于其他突變菌株，但到36 h時，各菌株的孢子萌發率相差不多，48 h各菌株的萌發率已經基本一致，均達到95%以上，表明各菌株在萌發上并沒有明顯區別。

圖2　各菌株生長情況比較

圖3　各菌株的萌發率比較

2.4.3與侵染相關的酶的活性

利用MCD培養基液體培養對抗性株和對照株6 d，發酵液離心取上清為粗酶液，分別測定酶活。結果如圖4所示，UV-I和UV-P菌株在各侵染相關酶活性方面都與對照菌株JN-CM相差不多，在蛋白酶和葡聚糖酶活性上甚至超過了JN-CM菌株，表現出了較高的活性。而UV-G菌株在酶的活性上都要略低于對照菌株，但是從數值上看，兩者差距很小。

圖4　各菌株與侵染相關酶的活性比較

3　結果與討論

由于在實際應用過程中，農民往往會將盾殼霉與農藥或化肥混合施用以降低使用成本，因此，考察盾殼霉對多種常用農藥和化肥的耐受性，并篩選相應的抗性菌株，對盾殼霉的推廣應用具有現實意義。研究表明，除草劑草甘膦，殺蟲劑吡蟲啉以及磷肥對盾殼霉菌株JN-CM的菌絲生長和孢子萌發有顯著影響。對菌株JN-CM進行紫外誘變，篩選得到3株具有穩定抗逆性的突變菌株。UV-G、UV-I和UV-P三種菌株都具有良好的菌絲生長情況，突變并沒有造成明顯影響，同時在孢子萌發方面，雖然突變菌株在前期萌發上低于對照JN-CM菌株，但是在到達36 h后已經處在同一水平，萌發率均在95%以上。UV-G菌株幾種侵染相關酶的活性要略低于對照，但是在數值上相差不多，仍然具有良好的活性。UV-I和UV-P菌株則具有更好的酶活性，分別在蛋白酶和葡聚糖酶活性方面要高于JN-CM菌株。

篩選得到的抗性突變株，可和上述試驗中采用的農藥及化肥混合施用，從而增加對菌核病的防效，并減少勞動成本，具有良好的應用前景。

[1]Bolangd GJ，Hall R．Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum[J]．Canadian Journal of Plant Pathology，1994，16(2)：93-108.

[2]Godoy G，Steadman JR，Dickman MB，etal．Use of mutants to demonstrate the role of oxalic acid in pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum on Phaseolus vulgaris [J]．Physiological & Molecular Plant Pathology，1990，37(3): 179-191．

[3]王道本．核盤菌論叢[M]．北京：北京農業大學出版社，1986.

[4]Campbell WA．A new species ofConiothyriumparasitc on sclerotia[J]．Mycologia，1947，39(2): 90-195．

[5]Huang HC，Hoes JA．Penetration and infection of Sclerotinia sclerotiorum byConiothyriumminitans. Can[J]．Canadian Journal of Botany，2011，54(5-6): 406-410．

[6]繆華軍，李國慶．盾殼霉抗殺菌劑vinclozolin的誘變及突變體的生防潛力[J]．中國生物防治，2006，22(1): 73-77．

[7]Giczey G，Kerenyi Z，Fulop L，etal．Expression of cmg1，an exo-beta-1，3-glucanase gene fromConiothyriumminitans，increases during sclerotial parasitism[J]．Applied and environmental microbiology，2001，67(2): 865-71.

[8]楊龍．生防菌盾殼霉防治油菜菌核病的生態學基礎及其應用研究[D]．華中農業大學，2009．

[9]周光明，王光，王嬡等．紫外誘變育種在瘤胃厭氧真菌中的應用效果研究[J]．中國草食動物科學，2013，33(4): 33-35．

[10]王慶云，韓巨才．盾殼霉寄生核盤菌過程中葡聚糖酶、幾丁質酶及電導率的變化[J]．山西農業大學學報，2006，26(1): 22-23．

[11]夏森玉，雷楗勇，金堅等．生防菌盾殼霉抗藥性突變菌株的選育[J]．工業微生物，2013，43(5): 57-62.

[12]劉旭艷．生防真菌盾殼霉抗殺菌劑菌核凈的誘變及其抗性機制分析[D]．武漢：華中農業大學，2009．

Breeding of stress resistance mutants about bio-control fungiConiothyriumminitans

JIN Qiang1， DUAN Zuo-ying2， XIA Sen-yu3， SHEN Zhi-song3， LI Hua-zhong2， JIN Jian1

1. School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,School of Biotechnology, Wuxi, Jiangsu 214122, China； 3. Wuxi Jiannong Biological technology co., LTD, Wuxi, Jiangsu 214122, China

Tolerance of wild-typeConiothyriumminitansstrain JN-CM were determined to selected pesticides and fertilizer. The results indicated that glyphosate, imidacloprid and phosphate fertilizer had significant inhibitory effects on the strain. Then the mutant stain with a certain degree of tolerance of glyphosate, imidacloprid and phosphate fertilizer were successfully screened through ultraviolet mutagenesis and named as glyphosate (UV-G), imidacloprid (UV-I) and phosphate fertilizer (UV-P), respectively. Three mutant strains had good genetic stability. Mutants had no significant differences between ability of growth and infection-associated enzyme activity if compared with those of wild-type strain，which showed their good application prospects.

Coniothyriumminitans; mutant strain; ultraviolet mutagenesis

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.002

2015江蘇省重點研發計劃(現代農業)重點項目(BE2015309)。

金強(1991～)，男，碩士研究生。E-mail：jinqiang19@126.com。

金堅，男，教授，博士生導師。Tel：0510-85918219，E-mail：jinjian31@126.com。