罐內水性涂料抗微生物侵染的試驗方法研究

郭曉苑，　李彩玲，　謝飛鴻，　劉靜霞，　周少璐，　謝小保

廣東省微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

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罐內水性涂料抗微生物侵染的試驗方法研究

郭曉苑，李彩玲，謝飛鴻，劉靜霞，周少璐，謝小保*

廣東省微生物研究所，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣州 510070

本文介紹了推薦性國家標準GB/T30792-2014《罐內水性涂料抗微生物侵染試驗方法》制訂的必要性及制訂依據。針對標準適用范圍、測試菌種、測試條件和實驗程序等內容分別進行了系統的描述。

水性涂料； 抗菌性能； 測試標準

水性涂料主要由乳液、顏料、填充料、助劑和水組成，為微生物的生長創造了良好的條件，在溫度適宜時會促使微生物在罐內生長繁殖產生代謝作用，從而引起產品pH值、氣味、色澤、凝聚、破乳、粘度等變化，造成產品變質。為了防止微生物在水性涂料儲藏和使用過程中的生長繁殖，保護產品不被破壞，須在水性涂料中加入防腐劑,抑制或殺死微生物，延長產品的保藏時間[1-4]。但是加入防腐劑后，水性涂料的抗微生物侵染的效果及其穩定性需要一個科學的檢測方法與評價體系來進行測試和評價，因此，建立抗微生物侵染功效的測試方法具有重要的實際意義。

目前水性涂料在罐內貯藏期間抗微生物侵染性能測試方法主要有美國材料與試驗協會標準ASTM D 2574-06《容器中乳化漆耐微生物侵染的試驗方法》，該標準于2012年進行了修訂，我國還沒有相關測試方法和評價標準，不同的企業、不同的協會測試時，采用的試驗菌種、接種方式、培養方法等都有一定的差異。因此為規范水性涂料抗微生物侵染功效的評價方法，防止水性涂料受到微生物污染，需要研究制訂水性涂料的抗微生物侵染的試驗方法和評價標準[5-6]。

1　測試菌種

水性涂料抗微生物侵染功效試驗中測試菌株的選擇非常重要。選用實際使用過程中經常污染的微生物，能更好地代表實際污染狀況和正確評價防腐體系的作用效果。一般應包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、酵母菌中的至少一種。由于使用前罐內涂料密封包裝，空氣少，不適合霉菌生長。因此霉菌引起罐內涂料變質的可能性較低。美國ASTM D 2574推薦使用假單胞菌(如銅綠假單胞菌)和腸桿菌(如產氣腸桿菌)，同時還可選擇從腐敗變質的涂料中分離的菌作為測試菌。

通過對我國水性涂料微生物污染情況的調查研究，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產氣腸桿菌和白色假絲酵母是常見的涂料中污染微生物，因此選用這些菌種進行抗微生物侵染功效試驗，本標準采用菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 10145，產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)ATCC 49701。

根據產品的用途，可增加其他細菌作為測試菌種。

2　接種和培養

培養方法有涂布培養法和稀釋培養法

涂布培養方法：稱取100 g供測試的樣品2份，分別接種1 mL細菌菌懸液和1 mL酵母菌懸液，充分混合均勻，將樣品保存在30 ℃±2 ℃條件下，并于0時、第3 d、第5 d、第7 d分別測定樣品中的細菌和酵母菌含量。如果第7d沒有檢測到微生物，則重新接種。將2個無菌棉簽分別浸入已接種的2個涂料試樣中，通過在容器側壁上輕輕擠壓棉簽去掉多余的涂料(大約有200 mg的涂料會留在棉簽上)。將接種細菌的棉簽頭上的涂料均勻地涂布在TSA平板表面上，將接種酵母菌的棉簽頭上的涂料均勻地涂布在PDA平板表面上(相對保持在棉簽上的200 mg涂料，約只有50 mg的涂料會被涂在平板上)，試驗重復3次。TSA平板置于36 ℃±1 ℃恒溫培養24 h～48 h，計數得到細菌菌落數， PDA培養基置于28 ℃±1 ℃培養48 h～72 h，計數得到酵母菌落數。

稀釋培養法：將供測試的樣品分成兩份各100 g，然后分別接種1 mL混合細菌液和1 mL酵母菌懸液，充分混合均勻，將樣品保存在30 ℃±2 ℃條件下，并于0 d、第3 d、第7 d、第14 d 、第21 d和第28 d分別測定樣品中的細菌和酵母菌含量。取10 g樣品加入到含90 mL稀釋液的錐形瓶中，充分搖勻做成1∶10的均勻稀釋液；吸取1∶10稀釋液1.0 mL加到9.0 mL稀釋液中，混勻做成1∶100稀釋液，依此方法可做成10倍遞增稀釋液。在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的移液管吸取1 mL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。細菌培養基采用TSA培養基，36 ℃±1 ℃恒溫培養24 h～48 h，酵母菌培養基采用PDA培養基。

3　防腐效果評價

涂布培養法按下表1對水性涂料抗微生物侵染功效進行等級評價，0級抗微生物效果最好，3級效果最差。

表1　涂布培養法抗微生物侵染功效分級表

稀釋培養法采用評價等級(見表2)為：細菌于第7 d時細菌菌落總數減少百分率，至第28 d時無增長，酵母菌于第7 d時菌落總數減少百分率，至第28 d時無增長等條件為產品的抗微生物性能設立4個評價等級即0級、1級、2級和3級。等級的判斷要以細菌和酵母菌同時符合要求為條件，如果細菌和酵母菌的評判等級有差異時，以數字大的等級作為最終的產品評價等級。

表2　稀釋培養法抗微生物侵染功效分級表

4　方法驗證

4.1防腐劑功效驗證

在水性涂料中加入不同抗菌劑或不同含量相同抗菌劑，采用單一菌接種培養和混合菌接種培養進行抗微生物侵染試驗。結果見表3。結果表明，除樣品F外，單一菌接種培養與混合菌接種培養的結果一致，由于混合菌接種法更能代表實際污染的條件和狀況，測試結果能真實反映產品抗微生物侵染的功效，能保證產品的安全，且更相對省時省力，因此混合菌接種的方法更容易被生產企業所采用和接受，所以本標準采用混合菌接種方法進行抗微生物侵染功效的測試和評價。

表3　抗微生物侵染效能測試結果

雖然采用涂布培養法和稀釋培養法測試結果的評價等級相同，但是測試過程中發現，涂布培養法計數時易受到水性涂料的的干擾，加入TTC后有助于菌落計數，但該法相對更加省時省力，而稀釋培養法計數不受水性涂料性狀的影響，結果更加穩定，但試驗工作量大且時間長。

4.2產品方法驗證

根據本標準試驗方法對市場上銷售的水性涂料產品進行了抗微生物侵染功效的檢測，檢測結果見表4。結果顯示市售水性涂料的抗微生物侵染效果較好，多數產品都達到了0級。1級和2級各有一個產品。檢測結果進一步驗證了該方法的可行性。

表4　市售水性涂料抗微生物侵染效能實驗

注：*為0 d的菌落數。

4.3比對試驗驗證結果

檢測人員對不同品牌水性涂料和對照樣進行了比對實驗，考核方法的重復性及可靠性，經過實驗證明不同的檢測人員對同一樣品測試結果的重復性較好，比對測試結果見表5。

5　結論

依據本研究制訂的國家標準GB/T30792-2014《罐內水性涂料抗微生物侵染試驗方法》，其部分內容參考了美國材料與試驗協會標準ASTM D 2574-06(2012))，并增加了涂料中其他常見的污染菌作為測試菌種，菌種代表性更強，為了更好的定量評價涂料的抗微生物侵染效果，參考ASTM E 640-06水性化妝品防腐功效的測試方法[7]，增加了稀釋培養法，引入了微生物減少百分率，能定量的表征涂料的抗微生物侵染效果，消除了微生物測試時的抗菌劑的抑菌作用，結果更加準確，使標準具有更強的可操作性和適用性。

表5　不同檢測人員的比對試驗

[1]陳逸君，楊光雄、朱優君.水性涂料及其原料的防腐、防霉.涂料工業[J].2003，33(3):49-50.

[2]謝俊斌, 陳北秋. 水性涂料罐內防腐殺菌劑穩定性研究[J]. 涂料工業, 2007, 37(3):59-61.

[3]王玉琦，楊云峰. 水性建筑涂料中防霉劑的選擇[J]. 中國涂料, 2005,20(5):46-49.

[4]彭紅，謝小保，歐陽友生等.涂料用防霉劑、抗菌劑和抗藻劑[J].中國涂料，2007,22(12):48-53.

[5]中華人民共和國國家標準，GB/T30792-2014 罐內水性涂料抗微生物侵染的試驗方法 [S].北京：中國標準出版社，2014:1-8.

[6]ASTM D 2575-2006(2012) Standard test method for resistance of emulsion paints in the container to attack by microorganisms[S]. West Conshohocken,2012.

[7]ASTM E640-2006(2012) Standard Test Method for Preservatives in Water-Containing Cosmetics[S]. West Conshohocken,2012.

Test method of water-borne coatings in containers for resisting microorganism contamination

GUO Xiao-yuan, LI Cai-ling, XIE Fei-hong, LIU Jing-xia, ZHOU Shao-lu, XIE Xiao-bao

Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070

The necessity and basis of developing recommended national standard GB/T30792-2014 test method of water-borne coatings in the containers for resisting microorganism contamination were introduced, and the applied scope of the standard, tested strains，testing conditions and testing procedures were described systematically.

water-borne coatings； antibacterial activity； test method

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.012

郭曉苑(1982～)，女，大學本科，研究方向，有害微生物防治。E-mail: 123736489@qq.com。

謝小保(1966～)，男，研究員，主要從事工業材料抗菌防霉機理的研究。E-mail：xiaobaoxie@126.com。