植物乳桿菌高活力保存方法的研究及其應(yīng)用

劉鵬揚(yáng)，　劉軍義，　呂春秋，　盧　煒，　趙永鋒

1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧 530021

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植物乳桿菌高活力保存方法的研究及其應(yīng)用

劉鵬揚(yáng)1，劉軍義2*，呂春秋2，盧煒2，趙永鋒2

1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2.廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣西 南寧 530021

本研究旨在探討植物乳桿菌的高活力保存方法，為植物乳桿菌飼料添加劑規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。采用4 ℃低溫保存法、36 ℃烘干后常溫保存法、陽離子活性載體保存法等3種方法對植物乳桿菌進(jìn)行活力保存比較試驗(yàn)。以保存后活菌數(shù)不低于原值50%為參照標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示，對照組可保存15 d，4 ℃低溫保存法可保存30 d，36 ℃烘干后常溫保存法只能保存一周，而陽離子活性載體保存法則可保存2個(gè)月以上。結(jié)果表明，陽離子活性載體保存法可應(yīng)用于植物乳桿菌飼料添加劑的規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐中。

植物乳桿菌； 高活力； 保存方法； 活性載體； 規(guī)模化

乳酸菌是指發(fā)酵糖類后主要產(chǎn)物為乳酸的一類沒有芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌。早在5000年前，人類就已經(jīng)利用乳酸菌，如制作泡菜、酸奶等。研究表明，乳酸菌對人的健康和長壽非常重要。目前，乳酸菌主要應(yīng)用于乳制品，如日本，乳酸菌制品已占乳制品市場的85%。近年來，為了應(yīng)對飼料抗生素殘留之風(fēng)險(xiǎn)，以乳酸菌為主力軍的微生態(tài)制劑開始興起。由于乳酸菌及其代謝產(chǎn)物除了可提高養(yǎng)殖對象的生長速度、存活率，并具有防病、治病、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效以外，還可以提高飼料的品質(zhì)，提升飼料的利用率。作為添加劑與傳統(tǒng)的抗生素、化學(xué)藥物相比，具有無公害、安全、高效的優(yōu)點(diǎn)，因此大有推廣普及之勢[1]。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，最適生長溫度為30 ℃～35 ℃，厭氧或兼性厭氧，菌體細(xì)胞為直或彎的桿狀，單個(gè)、有時(shí)成對或成鏈狀，最適pH 6.5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[2]。植物乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能定植于腸道發(fā)揮有益作用。它對腸道微生物菌群有重要影響，在食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域都具有很強(qiáng)的應(yīng)用潛力。近年來，隨著食品、飼料等需規(guī)模化生產(chǎn)的產(chǎn)品對發(fā)酵工藝的要求逐步提高，摸索發(fā)酵添加劑的高效高活力保存及安全使用便顯得更加重要。然而乳酸菌活力較弱，保存較為困難，迄今為止，最有效的保存方法仍然是真空冷凍干燥法[3]，此法可使乳酸菌保存3個(gè)月以上[4]。但此方法僅適用于菌種的保存而難被用于生產(chǎn)實(shí)踐。隨著乳酸菌飼料添加劑使用量的逐年增大，急需解決乳酸菌的大批量、常溫、高活力保存問題，從而為微生物作為飼料添加劑用于規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。為此，研究者們進(jìn)行了多方研究，如王成濤等人[5]研究了五味中草藥對乳酸菌生長及保存活力的影響，發(fā)現(xiàn)室溫條件下保存l周、2周、4周植物乳桿菌LP-2，加入l%青蒿的培養(yǎng)液，保存4周后比對照組活菌數(shù)增加了2.5倍；林燕文[6]研究了木棉花對乳酸菌生長及保存活力的影響，發(fā)現(xiàn)保存3周后，含有5%木棉花濃度的植物乳桿菌液中的活菌數(shù)為空白對照的16倍。然而，這些研究沒有給出保存后與保存前活菌數(shù)的比較情況，而且研究觀察的持續(xù)時(shí)間不夠長，實(shí)際操作也存在一定的困難，因此未見實(shí)際應(yīng)用。

菌種保存的具體方法很多，原理卻大同小異。其核心內(nèi)容就是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)適合其穩(wěn)定生存的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、營養(yǎng)緩釋以及添加保護(hù)劑或酸度中和劑等。目前的菌種主流保存方法包括傳代培養(yǎng)保存法、液體石蠟覆蓋保存法、冷凍保存法、凍干保存法、載體保存法等。在實(shí)踐中，如傳代培養(yǎng)法、冷凍干燥法等菌種保存方法只適用于少量菌種的長期保存，成本較高，對環(huán)境條件要求很嚴(yán)格，不適用于在普通環(huán)境下保持乳酸菌高活力以及便于生產(chǎn)大批量乳酸菌菌劑的生產(chǎn)實(shí)踐。與前幾種傳統(tǒng)保存方法相比，載體保存法則具有載菌量大、成本低廉、對環(huán)境要求低、菌種保存活力高、適用于生產(chǎn)實(shí)踐等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛開發(fā)應(yīng)用。菌種載體保存法的原理在于：使生長合適的微生物吸附在一定的具有特殊吸附能力的物質(zhì)上，使微生物保持生存狀態(tài)以達(dá)到微生物長期保存的目的。常見的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、 磁珠和濾紙片等。本文通過對乳酸菌的活力保存進(jìn)行了持續(xù)研究，提出了一種采用陽離子載體為介質(zhì)的、大批量、常溫、高活力的乳酸菌常溫保存方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

選用兩種來源植物乳桿菌作為供試菌種：一種為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，標(biāo)記為L199，另一種購自美國杜邦公司型號為Lactobacillusplantarum-115植物乳桿菌，標(biāo)記為Lp-115。將以上兩種菌種接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基[7]中保存?zhèn)溆茫菫榫N保存液。MRS液體培養(yǎng)基的配方是：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 5.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，醋酸鈉·3H2O 5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2。

1.1.2馬蹄汁

參照周愛梅等人的方法[8]進(jìn)行制作。鮮馬蹄去皮，清洗，燙漂后，勻漿，紗濾，3 000 g離心15 min，取上清，調(diào)可溶性固形物至1%。可溶性固形物用手持式折光儀測定、讀數(shù)。

1.1.3植物乳桿菌培養(yǎng)液

將L199以及Lp-115菌種保存液以1︰10的比例接種于馬蹄汁中，30 ℃培養(yǎng)24 h，是為L199與Lp-115植物乳桿菌培養(yǎng)液。

1.2方法

設(shè)計(jì)植物乳桿菌培養(yǎng)液的3種保存方法，L199分別編號為1#、2#、3#，Lp-115分別編號1’#、2’#、3’#，具體如下：

1#、1’#：低溫保存法。培養(yǎng)液直接置4 ℃下保存。

2#、2’#：烘干保存法。將L199及Lp-115培養(yǎng)液以1︰1的比例與預(yù)先烘干麩皮(M/M)混合，36 ℃，24 h烘干，然后置室內(nèi)自然環(huán)境下保存。

3#、3’#：陽離子活性載體保存法。將L199及Lp-115培養(yǎng)液與陽離子活性載體和麩皮按2︰1︰1的比例(M/M)均勻混合，然后置室內(nèi)自然環(huán)境下保存。

兩菌種培養(yǎng)液對照標(biāo)記為4#、4’#，培養(yǎng)液直接置室內(nèi)自然環(huán)境下保存，自然環(huán)境下溫度作為本試驗(yàn)的常溫。

試驗(yàn)開始時(shí)，測定樣品的乳酸菌數(shù)，然后每隔一周檢測一次，半個(gè)月后，每15 d檢測一次，試驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行2個(gè)月，當(dāng)乳酸菌數(shù)減少4個(gè)數(shù)量級時(shí)，停止計(jì)數(shù)。乳酸菌數(shù)的測定按GB 4789.35-2010方法[7]執(zhí)行。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，計(jì)算各保存方法下樣品中乳酸菌數(shù)與同期對照樣品的比值，同時(shí)計(jì)算它們與對照樣品初始值的比值。

2　結(jié)果

試驗(yàn)持續(xù)60 d，其中，室內(nèi)平均氣溫為22 ℃。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

從表中可以看出，植物乳桿菌L199和Lp-115培養(yǎng)液在4 ℃低溫下保存2個(gè)月之后，有效活菌數(shù)分別為為8.0×107CFU/mL和1.2×108CFU/mL，分別是各自常溫下放置對照樣品的4倍和3倍，分別是各自初始活菌數(shù)的27%和18%；烘干后常溫下保存， 1個(gè)月時(shí)有效活菌數(shù)已分別降低了4個(gè)數(shù)量級和3個(gè)數(shù)量級，2個(gè)月后的有效活菌數(shù)與初始活菌數(shù)相比，均幾近為零；用活性載體保存法，常溫下放置2個(gè)月，其有效活菌數(shù)分別為1.3×109CFU/mL和1.5×109CFU/mL，是各自常溫下放置對照樣品的65倍和50倍，是各自初始活菌數(shù)的5.2倍和4.7倍。結(jié)果表明，活性載體常溫保存法是比較好的一種乳酸菌活力保存法。

表1　3種保存方法對L199乳酸菌活力的影響結(jié)果

“/”表示未檢測。

根據(jù)表中數(shù)據(jù)作出3種保存方法對乳酸菌活力保存影響的曲線圖，結(jié)果示如圖1。

圖1　3種保存方法對受試乳酸菌活力保存的影響

從圖中可以看出，植物乳桿菌的確比較“嬌嫩”，若以活菌數(shù)減少不多于50%作為產(chǎn)品保存合格標(biāo)準(zhǔn)，則常溫下，兩種受試植物乳桿菌L199和Lp-115只能保存15 d左右，置4 ℃低溫下均只能保存30 d左右，烘干后置常溫下兩種受試植物乳桿菌均不超過一周，甚至在15 d左右時(shí)，幾乎全部失活。但是，用陽離子活性載體進(jìn)行保存，結(jié)果卻出乎意料的好，在前15 d，兩受試植物乳桿菌有效活菌數(shù)不僅沒有減少，而且還大幅上升，均幾近10倍，然后處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，即使在保存2個(gè)月之后，有效活菌數(shù)均保持1.0×109CFU/mL以上。

3　討論

本研究采用馬蹄汁為植物乳桿菌的培養(yǎng)液，是因?yàn)槲覈邱R蹄之鄉(xiāng)，每年有大量的馬蹄淀粉廢水排放，而所謂的廢水，其實(shí)質(zhì)就是馬蹄汁，因此本研究一開始就具有較強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。乳酸菌活力保存是世界性難題，所以現(xiàn)有乳酸菌活菌產(chǎn)品均需冷鏈銷售，且保質(zhì)期不超過30 d[9]，本研究也發(fā)現(xiàn)4 ℃低溫下，超過30 d其活力則減半。熱風(fēng)噴霧干燥的乳酸菌，數(shù)量只有(7.2±0.4)×102CFU/g[10]，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)烘干法不適合乳酸菌的保存，即使采用低溫(36 ℃)烘干法然后常溫保存，活菌數(shù)也迅速減少，30 d后，只有1×104CFU/g。目前，乳酸菌飼料添加劑還沒有制訂出國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，可能與常溫下乳酸菌劑的活力保存問題沒有解決有關(guān)。

令人興奮的是，本文以植物乳桿菌L199和Lp-115為試驗(yàn)菌株，發(fā)現(xiàn)用陽離子活性載體進(jìn)行常溫保存，效果良好，即使保存2個(gè)月，活力仍未見降低，活菌數(shù)保持在109CFU/g以上，而且與對照相比，L199的有效活菌數(shù)還達(dá)到令人驚奇的65倍。這種良好的效果除了得益于載體本身的保護(hù)作用外，可能還與陽離子載體的中和作用和麩皮的營養(yǎng)作用有關(guān)，一方面，陽離子載體中的物質(zhì)與乳酸進(jìn)行中和，解除了乳酸對植物乳桿菌生長的抑制作用，另一方面，處在半濕潤狀態(tài)下的麩皮不斷緩慢釋放出營養(yǎng)因子，為乳酸菌的持續(xù)生長和代謝提供了良好條件，因此才會出現(xiàn)如此奇特的效果。與此同時(shí)，此陽離子載體屬于天然礦物質(zhì)，自然界中保有量巨大，且容易獲得，已廣泛用于生物醫(yī)藥、食品加工、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及水體環(huán)境凈化，應(yīng)用前景廣闊。以此為據(jù)，本研究還試制了5 000 kg的乳酸菌飼料添加劑樣品提供給廣西某大型家禽養(yǎng)殖集團(tuán)和眾多養(yǎng)殖戶進(jìn)行試用，反饋的結(jié)果是：其肉雞養(yǎng)殖全程可以不施用抗生素等藥，特別明顯的是雞苗病死率降低46%以上，肉雞生長率提高17%，料肉比降低8.4%。

陽離子活性載體保存乳酸菌技術(shù)的進(jìn)一步研究和應(yīng)用，將推動相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂，實(shí)現(xiàn)乳酸菌飼料添加劑生產(chǎn)的革命，從而大大推動乳酸菌在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

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Methods forLactobacillusplantarumvitality preservation

LIU Peng-yang1, LIU Jun-yi2, LV Chun-qiu2, LU Wei2, ZHAO Yong-feng2

1. College of Food Science & Technology Shanghai Ocean University, Shanghai 201306； 2. Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureaue, Naning 530021

Methods forLactobacillusvitality preservation were investigated in order to find a good method which can be used for large scale production ofLactobacillusfeed additive. The methods such as stored at 4 ℃, dehydrated at 36 ℃ and using calcium ion active carrier absorption to preserveLactobacillusplantarumwere compared. With a standard that the valid bacteria was not less than 50% while being treated, the control sample could be preserved for 15 days; stored at 4 ℃ could be kept for 30 days; dehydrated at 36 ℃ could only last for one week; while using positive ion active carrier, it could be preserved for more than 2 months. As a result, the method using calcium ion active carrier preservation could be applied in large scale production ofLactobacillusfeed additive.

Lactobacillusplantarum; vitality; preservation; active carrier; large-scale

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.005

廣西科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項(xiàng)目(14-87-01A)。

劉鵬揚(yáng)(1995～)，男，大學(xué)本科學(xué)生。E-mail：550467974@qq.com。

劉軍義(1966～)，男，研究員，博士，長期從事微生物應(yīng)用研究工作。E-mail：ljy8463@163.com。