幾種常用防腐劑對日化產品中腐敗微生物抑制效果研究

楊　娟，　劉永龍，　林　芮，　梁　健，　陳　娟，　黃小茉,3，　邱曉穎,3*

1.廣東迪美生物技術有限公司，廣州 510663； 2.廣東省防霉抗菌工程技術研究中心，廣州 510070；3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070

?

幾種常用防腐劑對日化產品中腐敗微生物抑制效果研究

楊娟1,2，劉永龍1,2，林芮1,2，梁健1,2，陳娟1,2，黃小茉1,2,3，邱曉穎1,2,3*

1.廣東迪美生物技術有限公司，廣州 510663； 2.廣東省防霉抗菌工程技術研究中心，廣州 510070；3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣州 510070

了解幾種常用防腐劑在日化產品基質中的防腐效果。采用最低抑菌濃度方法測試卡松、對羥基苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇對腐敗微生物的抑菌活性；采用微生物挑戰性實驗驗證卡松、對羥基苯甲酸甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇和苯甲醇的抑菌效果。日化產品中分離的腐敗微生物對卡松耐受性接近0.0015%，接近《化妝品衛生規范》2007版的限定，其它4種防腐劑在規定的使用范圍內對分離的微生物都具有較好的抑制效果；卡松劑量在0.0015%、對羥基苯甲酸甲酯劑量在0.2%、咪唑烷基脲劑量在0.075%、苯甲醇劑量在0.2%時日化產品能通過微生物挑戰。日化企業應根據實際情況篩選、復配防腐劑，建立更加高效、經濟的防腐體系。

防腐劑； 最低抑菌濃度； 微生物挑戰實驗

日化產品指的是人們日常生活中使用的科技化學品，包括洗發水、沐浴露、化妝品等，隨著人們對日化產品的需求不斷提高，越來越多的生物原料被添加到日化產品中，在改善產品功能的同時，更增加了產品被微生物污染的機會[1-3]。近年來國內外關于市售日化用品微生物污染狀況調查研究表明，微生物指標不合格的產品仍然占有一定比例[4-6]。2015年本團隊共檢測了37家不同公司的2 037件日化產品，其中被微生物污染的共有179件，經過分離鑒定，發現在變質產品中檢出率最高的微生物為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；微桿菌(Microbacteriumsp.)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)；黑曲霉(Aspergillusniger)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)等。

為了保障日化用品品質安全，添加防腐劑成為抑制微生物污染的主要手段，但防腐劑添加量過少，易誘導細菌產生耐藥性，添加量過多，會對人體安全產生影響[7,8]，防腐劑的防腐效果評價是日化用品研發中的一個重要環節。我國一些機構的統計及美國FDA對防腐劑使用情況公布表明，日化用品的常用防腐劑主要有對羥基苯甲酸酯類(后文簡稱甲酯)、苯氧乙醇、甲基異噻唑啉酮(后文簡稱卡松)、咪唑烷基脲、苯甲醇等[9]。本研究采用最低抑菌濃度(MIC)和微生物防腐挑戰實驗評估這幾種防腐劑對日化產品中常見的腐敗微生物的防腐效果，選擇出使用量低且能夠有效抑制微生物生長的防腐劑，為日化企業選擇防腐劑提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

由某日化企業提供的未添加任何防腐劑的洗發水基質。

1.2培養基

卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。生化試驗培養基參見《微生物培養基的制造與應用》[10]。

1.3防腐劑

卡松、甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇，由廣東迪美生物技術有限公司提供。

1.4實驗菌株

從變質樣品中分離并鑒定的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa) JZK-055(洗發水)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JZK-064(沐浴露)；微桿菌(Microbacteriumsp.)JZK-137(洗手液)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)JZK-105(洗潔精)；黑曲霉(Aspergillusniger)JZK-110(面霜)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)JZK-133(面膜)。

1.5實驗方法

1.5.1霉菌孢子懸液和細菌懸液的配制[11]

將黑曲霉和繩狀青霉從甘油管中分別接種到PDA平板，置于恒溫培養箱中28 ℃培養7 d。培養好后用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫孢子，并稀釋至5×106CFU/mL (血球計數板計數)備用。將1.4中細菌分別從甘油管中接種到卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂培養基, 置于搖床上 37 ℃ 振蕩培養12 h，取菌液1 mL, 離心棄上清, PBS各洗滌1次, 并用PBS分別稀釋至5×107CFU/mL (測OD600)備用。

1.5.2不同防腐劑對腐敗微生物的MIC研究

以無菌操作用PBS分別將卡松稀釋成質量百分濃度為0.4%、0.3%、0.2%、0.15%和0.1%；甲酯濃度為20%、10%、5%、2%和1%；苯氧乙醇為40%、30%、20%、10%和5%；咪唑烷基脲濃度為10%、7.5%、5%、2.5%和1%；苯甲醇40%、30%、20%、10%和5%的稀釋液。制備100 mL的卵磷脂、吐溫80-營養瓊脂培養基和PDA培養基，將防腐劑按1%接種量加入培養基，制備成相應濃度的培養基：卡松濃度為(μg/mL)40、30、20、15和10；甲酯濃度為(μg/mL)2 000、1 000、500、200和100；苯氧乙醇濃度為(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500；咪唑烷基脲濃度為(μg/mL)1 000、750、500、250和100；苯甲醇濃度為(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500。分別傾注平皿。將制備的5×107CFU/mL菌懸液取100 μL于含防腐劑的培養基上，以同種濃度的菌懸液接種到不含防腐劑的培養基上做空白對照。

1.5.3化妝品中添加不同防腐劑的微生物挑戰實驗

本次實驗參考化妝品、 盥洗用品與香料協會(CTFA) 及美國藥典的微生物挑戰性實驗方法[12,13]。即將從變質日化用品中分離的霉菌混合后稀釋到5×106CFU/mL，分離的細菌混合后稀釋到5×107CFU/mL，分別取100 μL接種到50 g化妝品中，在第3 d、7 d、14 d、21 d和28 d用平板計數法檢測微生物的存活狀態。當細菌在七天之內至少減少99.9%，并且測試7d～28 d內沒有增加；霉菌在7 d之內應該至少減少90%，并且測試7 d～28 d內沒有增加判定為挑戰通過。

2　結果與討論

2.15種防腐劑對日化產品中分離微生物的最低抑制濃度

卡松、甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇、苯甲醇是目前國內外日化企業使用最為廣泛的幾類防腐劑。《化妝品衛生規范》2007版中規定對羥基苯甲酸酯的最大允許使用濃度為：混合酯0.8%，單酯0.4%；卡松的最大允許使用濃度為0.0015%；咪唑烷基脲的最大允許使用濃度為0.6%；苯氧乙醇和苯甲醇的的最大允許使用濃度為1%。

本實驗采用微生物學瓊脂稀釋法進行了需氧菌藥敏性最低抑制濃度測試。

表1　5種防腐劑對腐敗微生物的最低抑制濃度(μg/mL)

結果顯示，本實驗從變質樣品中分離的微生物對卡松的耐受性都比較高，接近或者超出了使用限量，可能是污染的微生物對卡松產生了耐受性。此外由于卡松含有氯離子，具有一定刺激性，國內外對它在日化用品中的使用限制越來越嚴格，卡松的安全性和其在日化產品中的使用情況需要進一步關注[14，15]，另外4種防腐劑在規定的使用范圍內對分離的微生物都具有較好的抑制效果。同時這幾類防腐劑對真菌的抑制效果要優于細菌。

不同微生物對不同防腐劑的敏感性差異較大，日化企業在挑選防腐劑時應根據配方的要求和風險微生物狀況通過實驗合理選擇，這對于日化產品微生物污染的預防，常用防腐劑的選擇具有重要意義。

2.2日化產品中添加不同防腐劑的微生物挑戰實驗

日化企業投產前對產品防腐體系的可靠性做效能測試是十分必要的，目前，國內外配方設計時普遍采用防腐挑戰性試驗評價防腐劑的有效性。通過微生物挑戰性實驗方法可以為企業選擇既能有效抑菌，又能達到最低添加量實現產品安全的防腐劑時提供參考。本次實驗參考化妝品、盥洗用品與香料協會(CTFA)及美國藥典的微生物挑戰性實驗方法，結果見表2。

表2　防腐劑對日化產品中分離細菌的挑戰性實驗(CFU/mL)

*細菌混合液：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；微桿菌(Microbacteriumsp)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia).

同一防腐劑對不同微生物有不同的MIC。配方設計時第一步會考慮MIC較小的防腐劑。本實驗根據5種防腐劑的MIC結果設計了3種劑量的微生物挑戰性實驗，結果顯示，5種防腐劑對霉菌抑制效果較好，都通過了霉菌混合液的挑戰實驗；但僅卡松劑量在0.0015%、甲酯劑量在0.2%、咪唑烷基脲劑量在0.075%、苯甲醇劑量在0.2%時能通過細菌混合菌液的挑戰實驗；苯氧乙醇在挑選的3個劑量均未能通過細菌混合菌液的挑戰實驗。而且通過微生物挑戰實驗的防腐劑劑量也要比MIC值要高。這說明選擇防腐劑時在參照防腐劑的MIC的同時還要考慮產品的配方因素, 確定適宜的防腐劑配方, 正確評價其性能后再投入使用。

表3　防腐劑對日化產品中分離霉菌的挑戰性實驗(CFU/mL)

*霉菌混合液：黑曲霉(Aspergillusniger)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum).

卡松含量在0.001%，甲酯含量在0.1%，咪唑烷基脲含量在0.05%，苯甲醇含量在0.4%時，單獨使用均未能通過微生物挑戰。將它們復配使用對日化產品中分離的細菌進行挑戰性實驗，結果見表4。

表4　防腐劑復配使用對日化產品中分離細菌的挑戰性實驗(CFU/mL)

結果表明，這4種防腐劑在一定濃度單獨使用時未能通過微生物挑戰，在復配使用后對分離細菌的抑制效果較好。但本實驗僅只針對洗發水基質，在其它不同配方體系產品中的抑菌效果還需進一步研究。

3　結論

本實驗選擇了市場上最常用的5種防腐劑，采用最低抑菌濃度(MIC)和微生物防腐挑戰實驗評估這幾種防腐劑對日化用品中常見腐敗微生物的的防腐效果。選取的5種防腐劑除卡松外，在規定的使用范圍內對分離的微生物都具有較好的抑制效果；除苯氧乙醇外在洗發水中單獨使用都能通過微生物挑戰性實驗，說明這幾種防腐劑在日化產品中雖然具有較好的防腐效果，但隨著在產品中長期使用，已經出現了耐藥性的趨勢，同時國家標準對防腐劑在日化產品中的使用限制越來越嚴格，如即將施行的《化妝品安全技術規范》2015版對卡松的使用范圍和使用劑量都進行了進一步限定。因此單一防腐劑已經無法達到有效抑菌的效果，復合防腐劑的使用是未來的趨勢。

通過將防腐劑復配使用既可以拓展抑菌譜，又可以減少每種防腐劑的用量，相對安全且經濟實惠。可以將具有良好抑菌效果的防腐劑重新組合，研究各組分之間在不同配方產品中的最優配比，建立更加高效、經濟的防腐體系。

[1]文霞,楊秀茳,謝小保. 化妝品微生物檢測技術的研究進展[J]. 日用化學工業,2015,2:110-114.

[2]孫維維. 天然動植物提取物在化妝品中的應用現狀和發展趨勢[J]. 牙膏工業,2009,19(3):47-50.

[3]Yorgancioglu A, Bayramoglu EE. Production of cosmetic purpose collagen containing antimicrobial emulsion with certain essential oils[J]. Industrial Crops and Products, 2013, 44: 378-382.

[4]韓偉,謝小玨,袁辰剛等. 進出口化妝品的衛生狀況及微生物種群分析[J]. 香料香精化妝品,2013,3:37-42.

[5]鄭萍,王友斌,丁培等. 化妝品的防腐劑使用情況與微生物污染關系的探討[J]. 中國衛生檢驗雜志,2015,12:2016-2018.

[6]Rethore S, Bourdes V, Lamquin A,etal. Effect of a cosmetic product containing non-replicating microorganisms (LA1) onStaphylococcusaureus(SA) colonization in atopic dermatitis (AD)[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2016, 136(5) Suppl.1: S50.

[7]Rushton L, Sass A, Baldwin A,etal. Key role for efflux in the preservative susceptibility and adaptive resistance ofBurkholderiacepaciacomplex bacteria[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, 57(7): 2972-2980.

[8]陳藝彩,謝小保,施慶珊等. 工業腐敗微生物種屬特性及抗藥性分析[J]. 微生物學通報,2010,10:1558-1565.

[9]高立雪,胡俊明,白雪濤. 進口和國產化妝品中常用防腐劑的使用情況[J]. 環境與健康雜志,2012,29(3):247-248.

[10]陳天壽. 微生物培養基的制造與應用[M]. 北京:中國農業出版社,1995.

[11]李文茹,施慶珊,莫翠云等. 幾種典型植物精油的化學成分與其抗菌活性[J]. 微生物學通報,2013,11:2128-2137.

[12]Muscatiello MJ. CTFAs preservation guidelines: a histories perspective and review[J]. C & T, 1993,108: 53- 59

[13]U. S. Pharmacopeial XX11: Microbiological tests, antimicrobial preservative effectiveness[M]. Rockford，M D: United States Pharmacopeial Convention, 1990: 1478-1479.

[14]司新生,楊俊偉,杭磊. 日化級異噻唑啉酮類殺菌防腐劑皮膚刺激實驗及其機理的研究[J]. 應用化工,2011,10:1789-1791.

[15]王友升,朱昱燕,董銀卯. 化妝品用防腐劑的研究現狀及發展趨勢[J]. 日用化學品科學, 2007, 30(12):15-18.

Effect evaluation of antiseptic preservatives commonly used in cosmetic products

YANG Juan1,2, LIU Yong-long1,2, LIN Rui1,2, LIANG Jian1,2, CHEN Juan1,2, Huang Xiao-mo1,2,3, QIU Xiao-yin1,2,3

1. Guangdong Demay Biological Technology Co., Ltd, Guangzhou 510663; 2.Guangdong Province antimicrobial Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510070; 3. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070

In order to understand the antiseptic effects of preservatives commonly used in cosmetic products, the minimal inhibitory concentration and microbiology challenge test was used to evaluate the effects of different preservatives on different microbes. In the actual cosmetics products, the kathon tolerance of the microorganisms separated from the contaminated cosmetics was nearly 0.0015%, close to the standard limit. The other four kinds of preservatives within the prescribed application range had good inhibition effects on microorganisms, such as kathon at 0.0015%, methyl p-hydroxybenzoate at 0.2%, imidazolidinyl urea at 0.075%, and benzyl alcohol at 0.2%, respectively. These cosmetic products could pass microbial challenge test. Based on actual circumstances, cosmetic product enterprises should screen various compounded preservatives for establishing more efficient and economical preservative system.

preservative; minimal inhibitory concentration; microbiology challenge test

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.007

廣東省科技計劃項目(2013B090600148,2013B050800023)，揭陽市產學研結合項目(201429)。

楊娟(1989～)，女，碩士，工程師，電話：020-8244095。E-mail：yangjuanhust@163.com。

邱曉穎(1962～)，女，教授級高工，主要從事工業微生物控制技術研究。E-mail：xyqiu29@163.com。