乳糖誘導劑促進P450 BM-3在大腸桿菌中可溶性表達的研究

張彭湃，　王松廷

河南大學生命科學學院，河南 開封 475004

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乳糖誘導劑促進P450 BM-3在大腸桿菌中可溶性表達的研究

張彭湃，王松廷

河南大學生命科學學院，河南 開封 475004

P450 BM-3是一種具有工業化應用潛力的單加氧酶，可催化飽和脂肪酸羥基化。為提高其在大腸桿菌宿主中的可溶性表達水平，采用乳糖作為誘導劑對P450 BM-3的誘導表達條件進行研究。結果發現：在大腸桿菌的OD600達到0.7～1.5時，添加2.0 g/L的乳糖、30 ℃誘導10 h可獲得最佳誘導效果。與IPTG的誘導效果對比發現：采用乳糖作誘導劑時，菌體生物量提高1.09倍，目標蛋白量提升2.13倍，蛋白包涵體的比例則降低至10%。研究結果表明：乳糖可顯著提升P450 BM-3在大腸桿菌中的重組表達水平，并且能夠促進p450 BM-3的可溶性表達。

P450 BM-3； 乳糖； IPTG； 誘導劑； 可溶性表達

P450 BM-3是一種具有羥基化活性的單加氧酶，能快速催化鏈長為C12～C20的飽和脂肪酸的ω-1、ω-2、ω-3位羥基化、催化不飽和脂肪酸的雙鍵環氧化[1]。通過定向進化等手段加以改造，P450 BM-3獲得了能催化花生四烯酸(AA)和二十碳五烯酸(EPA)[2]、催化亞油酸[3]生成白細胞毒素B、催化多環芳烴(PAHs)羥基化[4]、催化多氯聯苯[5]、催化吲哚生成靛藍[6]等多種功能，增強了其在醫藥、環境、農業、香料、染料工業等領域的應用價值。

P450 BM-3催化時能獨立完成電子的獲得、傳遞和底物的羥基化，而其他來源的P450酶必須通過P450還原酶(CPR)的輔助才能完成催化作用[7]。但是P450 BM-3分子量大(119 kDa)、結構復雜，在大腸桿菌中進行重組表達時，表達量低且易于形成包涵體[8]。實驗證明，添加血紅素的前體物質如β-氨基酮戊酸(ALA)，或添加適量FeCl3對提高P450 BM-3的表達量是有效的[9]，但如何提高P450 BM-3的可溶性表達水平卻一直未獲得大的進展。由于乳糖作為誘導劑時可以促進某些外源蛋白的可溶性表達[10]。因此，本文考察了以乳糖為誘導劑對P450 BM-3重組表達水平及重組蛋白可溶性的影響，為P450 BM-3的大規模制備奠定基礎。

1　材料與方法

1.1菌種、質粒與培養基

宿主E.coliBL21(DE3)，pET28a(+)-P450 BM-3重組質粒為實驗室保存。菌種培養及酶的表達采用LB培養基。

1.2方法

1.2.1IPTG誘導下的P450 BM-3表達

在含有50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB液體培養基中培養至OD600為0.6 ～ 0.8時，加入IPTG至濃度為0.5 mmol/L，然后在30 ℃，150 r/min下繼續誘導6 h后收獲細胞。

1.2.2乳糖誘導P450 BM-3重組表達的條件優化

對乳糖誘導濃度、誘導溫度、誘導時機及誘導持續時間等4個因素進行優化。

乳糖誘導濃度的優化：細胞在37 ℃培養至OD600為0.6～0.8，加入乳糖至終濃度為0.1 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L、2.0 g/L、5.0 g/L和10.0 g/L，30 ℃誘導表達10 h，收集細胞、提取粗酶液，比較粗酶液中的目標蛋白濃度以確定最適乳糖誘導濃度。

誘導溫度的優化：細胞在37 ℃培養至OD600為0.6～0.8，加入乳糖至最適誘導濃度，溫度選擇為25 ℃、30 ℃和37 ℃分別誘導表達10 h，對比粗酶液中的目標蛋白量。

誘導時機的優化：細胞在37 ℃下培養至OD600為0.3～0.5、0.6～0.8、1.0～1.2、1.4～1.6和1.8～2.1，加入乳糖至最適誘導濃度，并在最適誘導溫度下誘導表達10 h，對比粗酶液中的目標蛋白量。

誘導持續時間的優化：在最適誘導時機、乳糖濃度，誘導溫度下進行目標蛋白的誘導表達，每隔2 h測定目標蛋白濃度，直至目標蛋白量不再增加。

1.2.3P450 BM-3粗酶液的制備

誘導結束后收集菌體沉淀，生理鹽水洗滌，用1/5發酵液體積的破胞緩沖液重懸細胞后超聲破細胞。破胞緩沖液組成：100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)，50 mmol/L NaCl，15%甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。超聲破胞條件為：功率300 W，工作3 s，間歇4 s，冰浴，循環90次。經破碎后的懸液于4 ℃，15 000 r/min下離心30 min，上清部分即為粗酶液。

1.2.4粗酶液中P450 BM-3含量的測定方法

采用CO-差示光譜測定粗酶液中P450 BM-3的濃度[11]。

1.2.5乳糖與IPTG誘導效果的比較

比較乳糖與IPTG在各自的最佳誘導條件下的誘導結果。比較的指標有：生長曲線、最終的菌體量、可溶性P450 BM-3濃度及可溶性重組蛋白和包涵體的比例。其中，可溶性蛋白和包涵體的比例可通過軟件Quantity One 5.62對目標蛋白上清液與沉淀的SDS-PAGE分析獲得。

2　結果與分析

2.1乳糖最佳誘導條件的確定

乳糖作為誘導劑時，乳糖濃度、誘導溫度、誘導時機以及誘導持續時間對P450 BM-3表達的影響，分別如圖1A，1B，1C和1D所示。

圖1　乳糖誘導條件對P450 BM-3表達量的影響

采用軟件SPSS 17.0對乳糖、IPTG分別為誘導劑時對P450 BM-3的表達影響進行顯著性分析，計算不同考察條件下的F值及P值，結果顯示：不同乳糖濃度的誘導效果之間存在著極其顯著的差異(P<0.001)。

圖1A顯示，乳糖濃度較低時(0.1～0.5 g/L)，目標蛋白即有明顯表達，乳糖濃度0.1 g/L時即可獲得與IPTG誘導相當的表達水平，當乳糖濃度增加時，目標蛋白量也逐漸增加，乳糖達到2.0 g/L的時候，目標蛋白表達量到最大值(626.8 nmol/L，約80 mg/L)。

誘導溫度對目標蛋白表達量的影響如圖1B所示。30 ℃誘導時獲得的目標蛋白表達量最多(626.8 nmol/L)，而37 ℃下的目標蛋白表達量較30 ℃降低13%。其原因可能是：在較高溫度下，目標蛋白中相當一部分轉化成包涵體，而導致可溶性的目標蛋白減少。有報道稱，37 ℃下，菌體代謝旺盛，乳糖操縱子活力達到最高，目標蛋白肽鏈合成的速度，超過了菌體對其進行正確折疊的速度，結果導致形成包涵體，可溶性蛋白量減少[12]。有研究表明，低溫(如16 ℃)有利于重組蛋白的可溶性表達[13]，但是低溫下菌體生長趨慢，若想得到與適宜溫度下同樣的蛋白量，應當適當延長誘導時間。

誘導時機對目標蛋白表達量的影響如圖1C所示。結果表明：在OD600為0.7、1.1和1.5時誘導，獲得的最終目標蛋白量相差不大(610～640 nmol/L)，因此，在菌體生長到OD600為0.7～1.5時，添加乳糖可以獲得最好的誘導效果。DUNCAN分析顯示，采用乳糖，不同誘導時機下與采用IPTG相比，誘導效果均存在顯著差異。而在OD600為0.7、1.1和1.5時，誘導效果處于同一水平，不存在顯著性差異。

圖1D為誘導持續時間對目標蛋白量的影響。結果表明：在乳糖加入后的2 h內，目標蛋白并沒有出現；在誘導2 h ～4 h，目標蛋白開始出現；在4 h之后，目標蛋白大量被合成出來；誘導10 h后，所獲目標蛋白積累到最大值。誘導前期，目標蛋白沒有表達，是因為乳糖需經過乳糖透過酶的協助才能進入細胞，之后還需被β-半乳糖苷酶轉化為異乳糖才可以發揮誘導作用[12]。細胞需要一定的時間來合成利用乳糖所需的酶系，在誘導的初始階段，酶量較少，因此目標蛋白積累速度也較慢，待所需酶系大量合成后，目標蛋白的表達速率也隨之增長。

綜上所述，乳糖誘導表達的最適條件為：OD600為0.7～1.5時，加入2.0 g/L的乳糖，在30 ℃下誘導10 h。

2.2乳糖與IPTG誘導情況的比較

在最適誘導條件下分別用乳糖和IPTG對P450 BM-3進行誘導表達，結果如表1所示。

表1　乳糖與IPTG的最佳誘導條件下的誘導效果

乳糖誘導下，獲得菌體量是IPTG誘導下的2.09倍，但略低于不誘導時最終菌體量(OD600為7～8，圖2)。這是因為外源蛋白表達對細胞正常生長造成干擾，造成能量和營養物質的分流，因此會抑制生長[12]。IPTG不能被細胞利用，并造成代謝負擔，因此這種抑制作用很明顯；而乳糖對于細胞來說不僅是誘導劑，還是一種碳源，可以供給菌體生長需要。因此，乳糖的添加在一定程度上緩解了對外源蛋白的表達對菌體正常生長造成的營養物質的分流，從而使得菌體量并沒有明顯下降。

圖2　乳糖和IPTG誘導下宿主菌生長曲線比較

乳糖誘導下，可溶性P450 BM-3濃度達到626.8 nmol/L，是IPTG誘導結果的3.13倍?？紤]到最終的蛋白量取決于細胞總量與每個細胞的生產量，而乳糖誘導下最終菌體量是IPTG的2.09倍，所以在單個細胞的產量上，乳糖誘導效果更佳，為IPTG誘導的1.49倍。

采用IPTG誘導的時機選擇在OD600在0.6～0.8之間，這是一個比較狹窄的范圍。微生物生長過程中，OD600由0.6達到至0.8往往只需要十幾分鐘，IPTG誘導下，時間控制稍有偏差，蛋白得率往往就受到較大影響。而乳糖誘導的時機范圍寬廣(0.7～1.5)，較為寬泛的誘導時機有利于重組P450 BM-3大規模工業化生產時對生產質量的控制。

對于乳糖是否促進P450 BM-3的可溶性表達問題，對誘導產物的上清液與沉淀進行SDS-PAGE，如圖3所示。用軟件Quantity One 5.62估算包涵體所占比例，結果顯示：乳糖有效的降低了P450 BM-3的包涵體比例，使得這一比例由27%左右下降至10%以內。

分析乳糖有利于P450 BM-3可溶性表達的原因，可從誘導劑誘導強度及蛋白本身性質兩個方面去考慮。目標蛋白的可溶性表達與誘導劑的誘導強度有關，誘導強度與目標蛋白總量(可溶部分與包涵體之和)與誘導時間的比值正相關[14,15]。乳糖誘導下可溶目標蛋白量是IPTG的1.49倍，但乳糖誘導時間是IPTG的1.67倍，且IPTG誘導時以包涵體形式存在的目標蛋白大幅高于乳糖誘導，說明IPTG的誘導強度實際是高于乳糖的。IPTG加入后，導致目標蛋白迅速表達，以至無法及時正確折疊，從而形成包涵體。而以乳糖作為誘導劑時則相反，蛋白有充足的時間進行正確的折疊，從而提高了可溶性目標蛋白所占的比例。目標蛋白的可溶性表達也與蛋白本身特性有關，如分子量，結構以及折疊的難易程度等。對于分子量小，結構簡單的蛋白，其蛋白的正確折疊往往也比較容易。例如，三苯基甲烷類染料脫色酶具有較小的分子量(29.4 kDa)，該蛋白在工程菌中表達時，采用乳糖或IPTG誘導，其可溶性蛋白比例相似[16]。又如來源于大腸桿菌的NMN轉移酶，其分子量僅43 kDa，在IPTG誘導下也幾乎全部為可溶性表達[17]。而對于分子量較大，結構復雜的蛋白而言，相比之下，進行正確折疊更加困難，使用乳糖為誘導劑，往往能夠有效促進重組蛋白的可溶性表達。

3　結論

本研究以乳糖作為誘導劑，對P450 BM-3在大腸桿菌宿主中進行異源表達的效果進行考察。結果如下：(1)乳糖誘導P450 BM-3表達的最適條件為：OD600為0.7～1.5時，加入2.0 g/L的乳糖，在30 ℃下誘導10 h。(2)采用乳糖進行誘導，不僅顯著提高重組蛋白的表達量，而且降低了包涵體所占的比例。(3)采用乳糖誘導時，與IPTG誘導相比，添加誘導劑的最佳時間段范圍更寬，有利于P450 BM-3的大規模制備。本研究為P450 BM-3重組蛋白的大規模獲取及進一步深入研究創造了良好的條件，同時也為乳糖誘導劑應用于基因工程藥物研究及生產提供了有價值的參考。

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Enhanced soluble expression of cytochrome P450 BM-3 inE.coliby using lactose as inducer

ZHANG Peng-pai, WANG Song-ting

College of Life Science, Henan University, Henan Kaifeng 475004, CHINA

P450 BM-3 is a monooxygenase with the potential for industrial application. It can catalyze saturated fatty acids hydroxylation. In order to enhance the expression level and the solubility of P450 BM-3 inEscherichiacoliBL21 (DE3), studies was carried out with lactose as the inducer. The expressions conditions in shake flask were optimized. It was found that while 2.0 g/L lactose was added into the culture (OD600=0.7～1.5) and incubated at 30 ℃ for 10 hours, the yield of P450 BM-3 arrived at the maximum (80 mg/L). With lactose induction, the biomass was doubled, the amount of P450 BM-3 achieved 626.8 nmol/L, which was 3.13 times of that with IPTG induction. The solubility of P450 BM3 was also improved, for the inclusion bodies decreased to 10%. These data indicated that lactose was effective to improve the expression of P450 BM-3 inE.coliand would be conducive to the soluble expression of P450 BM-3.

P450 BM-3; lactose; IPTG; inducer; soluble expression

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.003

張彭湃(1978～)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工。E-mail：bio_apai@163.com。

項目名稱：河南省科技廳項目(162102210025)。