黃芩素通過WNT/β-catenin信號通路促進大鼠腱骨愈合

江華基，江小成，賀飛林，廖小卿，張文濤，張新濤北京大學深圳醫(yī)院運動醫(yī)學與康復科，廣東 深圳 50086；南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州50000

基礎研究

黃芩素通過WNT/β-catenin信號通路促進大鼠腱骨愈合

江華基2，江小成1，賀飛林1，廖小卿1，張文濤1，張新濤1
1北京大學深圳醫(yī)院運動醫(yī)學與康復科，廣東 深圳 510086；2南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州510000

目的 探討黃芩素對大鼠腱骨愈合的作用及相關分子機制。方法 取40只8周齡的雄性SD大鼠，隨機分為對照組（n=20）和實驗組（n=20）。兩組動物均行大鼠腱骨愈合模型造模。實驗組大鼠灌胃黃芩素10 mg/（kg·d），對照組灌胃等量的生理鹽水。術后3周、6周各處死10只大鼠并取材，通過生物力學、組織學觀察各組腱骨愈合的程度。此外，體外培養(yǎng)原代大鼠肌腱干細胞，加入不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）的黃芩素處理，14 d后分別進行ALP、茜素紅染色。Q-PCR、Western Blot檢測Runx2、OSX、OCN、一型膠原以及β-catenin的變化。隨后，在肌腱干細胞中加入10 μmol/L的黃芩素，并且加入WNT/β-catenin通路抑制劑DKK-1共培養(yǎng)，14 d后收集蛋白行Western Blot檢測，觀察β-catenin、Runx2以及OCN蛋白表達的變化。結果 生物力學結果顯示術后3周和術后6周時實驗組的腱骨愈合程度明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組織學結果顯示實驗組在術后3周和6周時腱骨界面細胞成熟程度更高，sharpey纖維生長密集度與間質(zhì)鈣化程度更高。ALP、茜素紅染色、Q-PCR和Western Blot結果顯示不同濃度黃芩素均能提高肌腱干細胞的ALP活性，增加礦化結節(jié)形成、提高Runx2、OSX、OCN、一型膠原和β-catenin的表達。而β-catenin抑制劑DKK-1后能顯著降低黃芩素的這種促成骨作用。結論 黃芩素可以有效促進腱骨界面細胞成熟與腱骨界面的膠原分泌，加速腱骨愈合并提高腱骨愈合質(zhì)量，這種促進作用呈現(xiàn)WNT/β-catenin信號依賴性。

黃芩素；大鼠；腱骨愈合；肌腱干細胞；WNT/β-catenin

自體軟組織移植物是目前臨床上最為常用的前交叉韌帶（ACL）重建替代物。然而，腱骨愈合時間過長與愈合結果差等問題卻一直未得到良好的解決。因此，加快骨道內(nèi)肌腱的腱骨愈合意義重大。近年來，人工骨、含鈣骨水泥、生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等被用來作為促進腱骨愈合的制劑，然而，這些制劑往往價格昂貴且來源有限，難以滿足臨床的大量需求。

黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根，是我國著名的傳統(tǒng)中藥，研究表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮(zhèn)痛、抗變態(tài)反應、抗糖尿病等廣泛的藥理學活性，黃芩素是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分之一［1］。據(jù)報道，黃芩素不僅能夠有效促進成骨細胞的成骨分化［2］，還能有效抑制破骨細胞的生成以及誘導破骨細胞的凋亡［3］。另一方面，有研究報道使用促進成骨中藥三七總皂苷可以有效促進腱骨愈合［4］。然而，國內(nèi)外尚無黃芩素對腱骨愈合影響的報道。同時，以往的研究顯示，在腱骨愈合過程中肌腱含有大量的肌腱干細胞，可能對腱骨愈合起著至關重要的作用［5］。然而，目前尚無研究討論經(jīng)典中藥單體對肌腱干細胞的影響。

本研究主要探討了研究黃芩素對大鼠腱骨愈合的影響，深入研究了黃芩素對肌腱干細胞增殖及成骨分化的作用以及機制，開拓中藥在骨科運動醫(yī)學領域的應用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），I型膠原酶（Sigma），中性蛋白酶（Roche），青霉素和鏈霉素（碧云天），胎牛血清（Gibco），0.02%EDTA與胰蛋白酶1:1混合液（廣州威佳科技有限公司），黃芩素（Sigma），CCK-8（日本DOjindo），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma），堿性磷酸酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），ALP染液（Sigma），茜素紅（Sigma）TRIzol RNA提取液（Life Technologies），Runx2、OSX、OCN、一型膠原（Col1α1）、β-catenin抗體均購于Santa Cruz公司，DKK-1（Sigma），細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、移液管購于Corning公司，4%多聚甲醛溶液（Sigma）。

1.2動物實驗方法

1.2.1動物模型 選取雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g（購買自南方醫(yī)科大學實驗動物中心），隨機分為實驗組和對照組。兩組實驗動物均進行右側大腿腱骨愈合手術，建立大鼠關節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植模型［6］。實驗組大鼠進行黃芩素灌胃10 mg/（kg·d），對照組大鼠進行等量的生理鹽水灌胃。術后3周、6周分別處死大鼠進行取材。

1.2.2生物力學檢測 術后3、6周處死大鼠后（n=5），小心將右側后肢自髖關節(jié)離斷，迅速轉移到含有4%多聚甲醛的離心管中，4℃保存，待所有標本收集齊后一同進行生物力學測試。測試前將標本置于常溫下復溫3 h，小心獲取脛骨近端移植肌腱復合物，去除內(nèi)側的固定紐扣，測量隧道的長度，將樣品兩頭用萬能材料測試儀的夾具夾緊固定，檢測時保持牽拉應力與骨隧道方向一致，以4.0 mm/s的速度施加應力，直至肌腱被拔出或斷裂，測試過程中用生理鹽水保持組織濕潤。應力及位移數(shù)據(jù)由測試儀的計算機軟件系統(tǒng)（Laboratory Technology Corporation，美國）自動生成，腱骨愈合強度用最大牽拉負荷與骨隧道長度比值表示。、

1.2.3蘇木素-伊紅（HE）染色術后3、6周動物處死后（n=5），立即取出脛骨近端移植肌腱復合物，去除移植肌腱以外的所有軟組織，置入體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定48 h；采用EDTA脫鈣1個月，隔天更換脫鈣液；隨后進行常規(guī)脫水、石蠟包埋，包埋時注意將骨隧道與石蠟表面垂直，采用連續(xù)切片的方法獲取隧道全長不同部位的組織切片，切片厚度為5 μm；常規(guī)蘇木精-伊紅染色觀察。

1.3細胞實驗方法

1.3.1大鼠肌腱干細胞的分離與培養(yǎng)取6周齡的雄性SD大鼠10只（購于南方醫(yī)科大學動物實驗），腹腔麻醉后進行原代肌腱干細胞分離與培養(yǎng)［7］。第3代肌腱干細胞用于以下實驗研究。

1.3.2CCK-8實驗 將第3代肌腱干細胞按5×104/個種植于96孔板，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0.1、1、10、100、1000 μmol/L的黃芩素，對照組加入等量的DMSO，每組設10個平行孔。14 d后根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，加入CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度（A值）。

1.3.3堿性磷酸酶（ALP）染色及活性檢測 取第3代肌腱干細胞，消化后按2×105/個種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設立4個復孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，隨后每孔加入0.5 mL 0.1%Triton X-100，置于常溫下15 min，然后根據(jù)南京建成ALP試劑盒說明進行ALP活性檢測。其它復孔將進行ALP染色，將肌腱干細胞用4%多聚甲醛固定20 min，隨后用PBS清洗3遍，在加入ALP染液，置于常溫下30 min，再用PBS洗去染液，進行拍照觀察。

1.3.4茜素紅染色及礦化結節(jié)測定取第三代肌腱干細胞，消化后按2×105/個種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設立4個復孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，經(jīng)4%多聚甲醛4℃固定30 min，行茜素紅（1 mg/mL）染色。茜素紅染色拍照后，每孔加入等量的氯化十六烷基吡啶溶液溶解礦化結節(jié)，酶標儀測OD=560，比較各組形成礦化結節(jié)的數(shù)量。

1.3.5熒光定量PCR（Q-PCR） 取第3代肌腱干細胞，消化后按2×105/個種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設立，4個復孔，每隔3天換液1次。14 d后棄去六孔板中的培養(yǎng)基，根據(jù)試劑盒說明用TRIzol提取總RNA，用NanoDrop 8000全光譜紫外-可見光分光光度計檢測RNA濃度，采用美國Bio-Rad公司的反轉錄cDNA合成試劑盒和Veriti?96-Well Thermal Cycler儀器進行cDNA反轉錄，反轉條件為25℃5 min，42℃30 min和85℃5 min。將反轉錄得到的cDNA根據(jù)逆轉錄試劑盒進行加樣，應用ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀進行PCR檢測，PCR反應條件為95℃10 s，60℃10 s，72℃10 s，共40個循環(huán)。讀取CT值后以GAPDH的CT值作為內(nèi)參，采用2-ΔCt法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.6蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）取第3代肌腱干細胞，消化后按2×105/個種植于六孔板，隨后加入含有不同濃度（0、0.1、1、10 μmol/L）黃芩素的成骨培養(yǎng)基（DMEM、10%FBS、青霉素、鏈霉、50 μmol/L抗壞血酸、0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/Lβ-磷酸甘油）。每組設立，4個復孔，每隔3 d換液1次。14 d后棄去培養(yǎng)基，加入PBS漂洗2遍后，加入500 μL的細胞裂解液于冰上靜置30 min使細胞充分裂解。4℃12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法進行總蛋白濃度的測定。95℃變性4 min，各組取含20 μg蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將蛋白質(zhì)轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床振蕩封閉2 h，然后分別加入一抗，4℃過夜。次日加入二抗，37℃孵育2 h，每進行下一步實驗前PVDF膜均用4℃預冷的TBST搖床漂洗4次，每次8 min，用增強化學發(fā)光法檢測目的蛋白，X光片曝光時間視效果而定，灰度值使用Image-Pro plus6.0進行掃描測定。

1.4統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1黃芩素提高大鼠腱骨愈合的生物力學強度

在術后3周和6周，分別取材進行生物力學檢測腱骨愈合強度（N/mm），結果顯示術后3周和術后6周中實驗組的腱骨愈合強度顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2黃芩素對Yamakado界面形態(tài)分型的影響

兩組動物Yamakado界面形態(tài)分型結果顯示術后3周：對照組腱骨界面主要為疏松結締組織，其中7例為結締組織，3例腱骨分離；實驗組腱骨界面主要為結締組織，其中3例間接連接，6例為結締組織，1例為腱骨分離。術后6周：對照組腱骨界面以結締組織為主，其中5例為間接鏈接，5例結締組織；實驗組腱骨界面主要為較致密的結締組織，其中8例為間接鏈接，2例為結締組織。兩組均未出現(xiàn)典型的直接連接。

2.3黃芩素促進腱骨界面的骨化形成

術后3周，對照組腱骨界面內(nèi)大量成纖維細胞聚集，細胞混亂無固定排列，骨隧道附近未見軟骨樣細胞，間質(zhì)鈣化不明顯，隧道壁表面新骨量少（圖1A）；實驗組腱骨界面內(nèi)有大量成纖維細胞聚集，細胞排列有序，骨隧道附近有軟骨樣細胞出現(xiàn)，并且細胞間質(zhì)有鈣化趨勢，隧道壁表面新骨較多（圖1B）。術后6周，對照組腱骨界面有6個標本出現(xiàn)sharpey纖維，排列教紊亂，隧道壁附近發(fā)現(xiàn)有軟骨樣細胞，且細胞基質(zhì)有鈣化趨勢，隧道壁表面少量新骨，但腱骨界面內(nèi)無新骨形成（圖1C）；實驗組的所有腱骨界面均有明顯的sharpey纖維連接，排列有序，骨隧道附近軟骨樣細胞較多，基質(zhì)鈣化明顯，腱骨界面內(nèi)還有片狀新骨形成，隧道壁表面新骨形成多（圖1D）。

2.4黃芩素對肌腱干細胞增殖的影響

使用不同濃度的黃芩素處理肌腱干細胞14 d后，CCK-8結果顯示0.1、1、10、100 μmol/L的黃芩素對肌腱干細胞的生長沒有明顯毒性，而1000 ng/mL的骨碎補總黃酮對肌腱干細胞生長有顯著的抑制作用。

2.5黃芩素促進肌腱干細胞的成骨分化

在用0.1、1、10 μmol/L的黃芩素處理肌腱干細胞14 d后，ALP釋放量及ALP染色結果（圖2A）顯示不同濃度的黃芩素均能促進肌腱干細胞ALP的分泌，并且呈濃度依賴性增加。同樣，茜素紅染色和礦化結節(jié)計數(shù)結果顯示黃芩素能顯著促進肌腱干細胞的礦化（圖2B）。Western blotting結果顯示不同濃度黃芩素可以促進成骨因子（Runx2、OSX、OCN、Col1α1）表達，并且呈濃度依賴性增加（圖3）。

2.6黃芩素通過激活WNT/β-catenin信號通路促進腱骨愈合

Western blottingt結果顯示，不同濃度的黃芩素能促進肌腱干細胞的β-catenin蛋白的表達，并且呈濃度依賴性增加（圖4A）。在加入DKK-1后，能有效抑制黃芩素對β-catenin蛋白的促進作用（圖4B）。

3　討論

腱骨界面的骨化程度對腱骨愈合具有重要的意義，過往的研究表明，黃芩素可以通過mTORC1信號通路促進成骨細胞的成骨分化［2，8-9］，并有效抑制破骨細胞的激活［3］，此外，黃芩素還能有效緩解去卵巢小鼠的骨丟失［8］。在活體實驗中，我們發(fā)現(xiàn)黃芩素干預組的大鼠愈合界面的生物力學強度顯著高于對照組，而Yamakado界面形態(tài)分型中，黃芩素組的腱骨愈合類型優(yōu)于對照組。同時，經(jīng)黃芩素干預后，腱骨界面膠原生長旺盛，且早于對照組出現(xiàn)sharpey纖維。以上結果都提示黃芩素可以在體內(nèi)可以有效促進大鼠腱骨界面的愈合。

移植的肌腱中含有肌腱干細胞，在創(chuàng)傷后被炎癥反應激活［10］，肌腱干細胞與間充質(zhì)干細胞相似，可以在不同條件下向成骨、成脂及成軟骨方向分化［11］，而其成骨分化在腱骨愈合的過程中起著重要的作用。本研究中選用肌腱干細胞作為突破點，在體外實驗中探討了黃芩素對肌腱干細胞成骨分化的作用及機制，闡明黃芩素促進腱骨愈合的作用機理。骨形成是腱骨愈合中的一個重要步驟，因此肌腱干細胞的成骨分化對腱骨愈合具有重要的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素能有效促進肌腱干細胞的成骨分化，并且這種促進作用呈現(xiàn)濃度依賴性。

WNT/β-catenin信號通路是一個調(diào)控細胞生長、發(fā)育和分化的重要信號途徑。近年來，有大量研究報道WNT/β-catenin信號通路在成骨分化及骨形成過程中扮演著重要角色［12］。首先，黃芩苷可以激活WNT/ β-catenin信號通路促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化［13］，另一方面，機械牽張應力可以通過激活WNT/ β-catenin信號通路促進肌腱干細胞的成骨分化［14］。本研究結果顯示，黃芩素在促進肌腱干細胞成骨分化的同時，激活了WNT/β-catenin信號通路，而在使用WNT/ β-catenin信號通路抑制劑DKK-1后可以顯著抑制黃芩素的促成骨作用。因此可以推斷出黃芩素是通過WNT/β-catenin信號通路促進肌腱干細胞成骨分化，從而促進腱骨界面的骨形成。

綜上所述，黃芩素可以通過激活WNT/β-catenin信號通路促進肌腱干細胞的成骨分化，達到腱骨愈合。本實驗首次從肌腱干細胞角度探討了對腱骨愈合的機制，揭示了黃芩素可以通過激活WNT/β-catenin信號通路促進肌腱干細胞的成骨分化，并且成功建立了大鼠關節(jié)外骨隧道-游離肌腱移植模型，驗證了中藥黃芩的有效成分黃芩素在腱骨愈合中的促進作用。本研究有肯定黃芩素對腱骨愈合的影響，從而為黃芩素的臨床研究和推廣應用提供初步的理論依據(jù)，開拓中藥在骨傷科及運動醫(yī)學領域的應用。

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Baicalein promotes rat extra-articular tendon-to-bone transplanting healing through WNT/β-catenin signaling

JIANG Huaji2，JIANG Xiaocheng1，HE Feilin1，LIAO Xiaoqing1，ZHANG Wentao1，ZHANG Xintao1
1Department of Sports Medicine and Rehahilitation，Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen 510086，China；2Department of Orthopedics，The Third Affiliated Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510000，China

Objective To investigate the effect of baicalein on tendon healing in bone tunnel and reveal its related molecular mechanism.MethodsIn vivo，40 Sprague Dawley male rats were used to establish rat extra-articular tendon-to-bone transplanting healing，then randomly divided into 2 groups.Experiment group was treated with baicalein 10 mg/（kg·d），while control group was treated by normal saline（0.9%）with the same volume.Biomechanical testing and histological detection were tested at 3 weeks and 6 weeks after surgery.In vitro，tendom stem cells were isolated from rat Achilles tendon，and being treated with various concentrations of baicalein for 14 days.The expression of alkaline phosphatase（ALP）and mineralized nodule was detected by ALP activity/staining assays and Alizarin red staining respectively，while the expression of Runx2，OSX，OCN，Collagen I were tested by Q-PCR and the expression of Runx2，OSX，OCN and β-catenin were evaluated by Western Blot assay.Results Tendon bone healing strength of experiment group was obviously stronger than control group in 3 weeks as well as in 6 weeks.In experiment group，there were more mature fibroblasts，more Sharphey fibers，and larger new bone formation area compared with control group.After intervention for 14 days，the expression of ALP，Runx2，OCN and VEGF were up-regulated，and WNT/β-catenin signaling were enhanced in vitro.Conclusion Baicalein can promotes osteogenic differentiation of tendon stem cells through WNT/β-catenin signaling in vitro，and stimulate tendon-bone healing in bone tunnel and enhance the connection between tendon and bone.

baicalein；rat；n tendon-bone healing；tendon stem cells；WNT/β-catenin signaling

2016-05-21

深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（201302058）

江華基，在讀碩士研究生，E-mail:gukejianghuaji@163.com

張新濤，博士，副主任醫(yī)師，E-mail:zhangxintao@sina.com