高效液相色譜內標法測定奶粉中三聚氰胺

邸萬山

（遼寧石化職業技術學院 應用化學系，遼寧 錦州 121001）

高效液相色譜內標法測定奶粉中三聚氰胺

邸萬山

（遼寧石化職業技術學院 應用化學系，遼寧 錦州 121001）

以雙氰胺為內標物，采用高效液相色譜內標法測定奶粉中三聚氰胺的含量，通過對色譜條件的優化，最后確立了有效的檢測方法。樣品經20 mL 50℃熱水，0.5g無水硫酸鎂，10 mL乙腈提取后，采用Nova-Pak C18色譜柱（3.9 mm×15 mm×5 μm）分離，以0.01 mol/L乙酸銨∶乙腈=90∶10（V∶V）作為流動相，218 nm為檢測波長。結果表明，雙氰胺在該條件下能夠與三聚氰胺完全分離，可以作為測定三聚氰胺的內標物。在0.500～1.500 mg/kg的添加范圍內，三聚氰胺的回收率為98.2%～100.5%。精密度實驗結果相對標準偏差為0.44%。所測定奶粉樣品中三聚氰胺為0.223 mg/kg。此法處理樣品處理簡便易行，回收率、準確度高，分析速度快，具有良好的重復性和再現性，適于測定奶粉中的三聚氰胺。

三聚氰胺；高效液相色譜法；奶粉

三聚氰胺作為一種價格低廉的有機化工原料，其最大的特點就是含氮量高（質量分數為66.6%），摻假增氮效果明顯，成本低。因此，在技術上和經濟上存在奶粉中摻加三聚氰胺的可能。研究表明，三聚氰胺長期累計攝入會導致腎、輸尿管和膀胱結石，并有生殖系統損傷的可能性［1］。因此有必要對奶粉中的三聚氰胺進行監測，明確其實際含量，防患于未然。

奶粉中總氮質量分數測定國家標準中使用凱氏定氮法，該方法對設備要求低，操作相對簡單，但精度差。國家規定奶粉中殘留三聚氰胺限量＜1 mg/kg。液態奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的產品一律不得銷售。含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，高于2.5 mg/kg的產品一律不得銷售。目前，三聚氰胺的分析方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography， HPLC）［2-5］、氣質聯用法（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）［6-7］、液相色譜串聯質譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）［8-11］，大多采用外標法進行測定。外標法容易受到測定條件變化而影響測定結果。而用雙氰胺作為內標物測定奶粉中三聚氰胺的測定方法報道較少。本實驗以雙氰胺為內標物，探索利用高效液相色譜內標法檢測奶粉中的三聚氰胺含量，體現了內標法測定奶粉中的三聚氰胺含量時避免了因進樣體積、檢測器靈敏度、流速以及流動相組成發生變化對測定結果的影響。具有回收率高、準確度高的特點。期望為奶粉的質量評價提供依據。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

奶粉樣品：市售；雙氰胺、三聚氰胺：國家標準物質研究中心；乙腈色譜純（0.45 μm濾膜過濾，超聲波脫氣）：國藥集團化學試劑有限公司；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm，0.50 μm膜過濾）；乙酸銨（優級純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

810型高效液相色譜儀：美國Waters公司；KQ-700DB數控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；AUW120D電子分析天平：日本島津公司。

1.3試驗方法

1.3.1色譜檢測條件

色譜柱：Nova-PakC18（3.9mm×15mm×5μm）；流動相：乙腈/0.01 mol/L乙酸銨（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：λ=218 nm；靈敏度：0.2 AUFS；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL。

1.3.2溶液的配制

1.0000 mg/mL雙氰胺、三聚氰胺混合標準貯備溶液的配制：準確稱取雙氰胺、三聚氰胺各0.100 0 g，用乙腈溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容、搖勻，0.45 μm濾膜過濾。

0.1000 mg/mL雙氰胺、三聚氰胺混合標準使用溶液：準確移取雙氰胺、三聚氰胺混合標準貯備溶液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度、搖勻，0.45 μm濾膜過濾，300 W超聲波脫氣10 min。

1.3.3試樣的處理

準確稱取奶粉樣品10.000 0 g于50mL具塞離心管中，加入20 mL 50℃熱水，0.5 g無水硫酸鎂，混勻，冷卻至室溫。再緩慢加入10 mL乙腈，渦旋1 min后超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min。將離心液全部轉移至100 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.001 0 mg雙氰胺，溶解后加入乙腈至刻度，搖勻。0.45 μm濾膜過濾，超聲波脫氣。處理液供液相色譜測定。

1.3.4雙氰胺、三聚氰胺的定性分析

將雙氰胺-三聚氰胺標準使用溶液及試樣處理液10 μL在相同的色譜條件下分別注入高效液相色譜儀進行分離，以標準使用溶液色譜峰的保留時間為依據對試樣處理液中的成分進行定性、定量分析。

1.3.5三聚氰胺對內標物雙氰胺的相對響應值

取雙氰胺-三聚氰胺混合標準使用溶液10 μL注入高效液相色譜儀進行分析，得到雙氰胺-三聚氰胺的峰面積。計算三聚氰胺對雙氰胺的相對響應值。

三聚氰胺對雙氰胺的相對響應值Sa計算公式如下：

式中：Aa、As分別為混合標準使用溶液中三聚氰胺、雙氰胺的峰面積；Wa、Ws分別為混合標準使用溶液中三聚氰胺、雙氰胺的質量，mg。

1.3.6試樣中三聚氰胺的定量分析

取試樣處理液10 μL，注入高效液相色譜儀進行分析，得到雙氰胺、三聚氰胺的峰面積，根據相對響應值計算奶粉試樣中三聚氰胺的質量。計算試樣中三聚氰胺含量的公式如下：

式中：W三聚氰胺表示樣品中三聚氰胺的質量，g；W樣雙氰胺表示樣品中雙氰胺的質量，g；A三聚氰胺表示試樣中三聚氰胺的峰面積；A樣雙氰胺表示試樣中三聚氰胺的峰面積；W樣表示樣品質量，g。

2　結果與分析

2.1檢測波長的選擇

根據參考文獻［13］，三聚氰胺、雙氰胺分別在波長218 nm、210 nm處有較大紫外吸收，在此基礎上，在波長200～400 nm處進行紫外光譜掃描，結果如圖1所示。由圖1可知，三聚氰胺、雙氰胺最大吸收波長分別為226nm、215nm，2種物質在波長218 nm處都有明顯吸收。因此，選擇218 nm作為檢測波長。

圖1　雙氰胺、三聚氰胺紫外吸收光譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of cyandiamide and melamine

2.2內標物的選擇

選擇雙氰胺作為內標物符合以下3點的要求：一是奶粉試樣中不應含有內標物雙氰胺；二是雙氰胺與三聚氰胺的分離度＞1.5；三是雙氰胺的加入量與三聚氰胺的峰面積匹配性＞75%［14］，故雙氰胺滿足做內標物的要求。

2.3標準品及樣品HPLC色譜圖

采用高效液相色譜法對混合標準溶液及奶粉樣品按照色譜工作條件的要求進行檢測，所得到的色譜圖見圖2。

由圖2可知，待測樣品色譜圖中出現雙氰胺、三聚氰2個色譜峰與混合標準溶液色譜圖中出現雙氰胺、三聚氰2個色譜峰一一對應，并且分離效果良好。因此，雙氰胺可以作為測定三聚氰的內標物。

圖2　雙氰胺和三聚氰胺混合標準液（A）和奶粉試樣（B）HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of dicyandiamide and melamine mixed standard（A）and milk powder sample（B）

2.4精密度的測定

取三聚氰胺標樣，平行進樣5次，檢測到三聚氰胺標樣的相對響應值分別為1.105、1.092、1.098、1.095、1.097，平均值為1.097。計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），RSD值為0.44%。結果顯示，該方法的精密度高，能滿足奶粉中三聚氰胺的分析要求。

2.5加標回收率試驗

在已知含量的試樣中分別加入不同質量濃度的三聚氰胺標準溶液進行回收率試驗，結果見表1。

表1　奶粉中三聚氰胺加標回收率結果Table 1 Standard addition recovery results of melamine in milk powder

從表1可以看出，三聚氰胺在0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范圍內，其回收率為98.2%～100.5%，表示該方法的準確度較高。

2.6奶粉樣品的檢測

對奶粉供試液進行檢測，計算其三聚氰胺的含量，結果見表2。由表2可知，待測奶粉中三聚氰胺的含量平均值為0.223 mg/kg。國家規定奶粉中殘留三聚氰胺限量＜1 mg/kg，該奶粉樣品達到質量要求。

表2　奶粉中三聚氰胺的檢測結果Table 2 Detection results of melamine content in milk powder

3　結論

通過以雙氰胺作為測定三聚氰胺的內標物，建立了高效液相色譜內標法在測定乳制中三聚氰胺的方法。該方法在三聚氰胺0.500 0～1.500 0 mg/kg添加范圍內，其回收率為98.2%～100.5%；精密度試驗結果相對標準偏差RSD值為0.44%；反映了內標法避免了因進樣體積、檢測器靈敏度、流速以及流動相組成發生變化對測定結果的影響［15］。具有回收率高、準確度高的特點。該方法分析速度快，成本低，測定結果準確可靠，具有良好的重復性和再現性等優點，是一種很好的檢測乳制中的三聚氰胺的方法，易于推廣，適用于實驗室日常檢測工作。

［1］焦嫚，董學芝.三聚氰胺分析檢測方法的研究進展［J］.化學研究，2010，21（1）：91-95.

［2］楊云霞，劉形，周桂英，等.小麥谷元粉中三聚氰胺的高效液相色譜法測定［J］.分析測試學報，2008，27（3）：322-324.

［3］占春瑞，郭平，溫志海，等.液相色譜檢測飼料中三聚氰胺殘留量的方法研究［J］.飼料研究，2007（11）：18-19.

［4］張美金，林海丹，林峰，等.高效液相色譜法測定飼料和寵物食品中三聚氰胺含量［J］.中國衛生檢驗雜志，2007，17（12）：2205-2206.

［5］趙永彪，李自春，劉婷，等.高效液相色譜法測定寵物食品中的三聚氰胺［J］.分析實驗室，2008，27（5）：190-191.

［6］宮小明，董靜，孫軍，等.HPLC法測定植物性原料中三聚氰胺［J］.食品科學，2008，29（4）：321-322.

［7］蔣晨陽，范倩，林德清，等.氣質聯用法測定飼料中的三聚氰胺［J］.飼料工業，2008，29（8）：48-50.

［8］丁濤，徐錦忠，李健忠，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測法及高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺［J］.色譜，2008，26（1）：6-9.

［9］李愛軍，張代輝，馬書民，等.液相色譜-串聯質譜法測定飼料中三聚氰胺殘留［J］.分析化學，2008，36（5）：699-701.

［10］梁華正，劉清，楊水平，等.奶粉中三聚氰胺等偽蛋白的危害和新檢測方法［J］.大學化學，2009，24（1）：14-18.

［11］馮家望，蔡勤仁，柳訓才，等.高效液相色譜-電噴霧串聯技術測定奶及奶制品中三聚氰胺和環丙氨嗪 ［J］.現代食品科技，2004，24（10）：1058-1059.

［12］賴碧清，鄭曉航，韓銀濤.高效液相色譜-四極桿質譜聯用測定飼料中三聚氰胺含量［J］.飼料工業，2008，29（4）：47-48.

［13］程莎，李建兵，王暉，等.高效液相法測定化肥中雙氰胺和三聚氰胺的方法研究［J］.現代化工，2014，34（3）：166-168.

［14］于世林.高效液相色譜方法及應用［M］.北京：化學工業出版社，2010.

［15］袁東，劉光增，劉國鵬，等.高效液相色譜法測定乳制品中的三聚氰胺［J］.齊魯師范學院報，2012，27（5）：53-55.

Determination of melamine in milk powder by HPLC internal standard method

DI Wanshan

（Department of Applied Chemistry，Liaoning Petrochemical Vocational and Technical College，Jinzhou 121001，China）

With dicyandiamide as internal standard，the content of melamine in milk powder was determined by HPLC internal standard method. The effective detection method was finally established by optimizing chromatographic conditions.Sample was extracted by 50℃hot water 20 ml，anhydrous magnesium sulfate 0.5 g and methyl cyanide 10 ml，separated by Nova-Pak C18chromatographic column（3.9 mm×15 mm×5 μm），with 0.01 mol/L ammonium acetate∶acetonitrile=90∶10（V∶V）as mobile phase，218 nm as detection wavelength.The results showed that the dicyandiamide was completely separated with melamine，and it can be used as the internal standard determination of melamine.Within the limits of adding 0.500-1.500 mg/kg，the recovery was 98.2%-100.5%，the relative standard deviation of precision results was 0.44%.The determination of melamine in milk powder samples was 0.223 mg/kg.The method was easy，simple，with high recovery and accuracy，fast analysis speed，with good repeatability and reproducibility.It was suitable for determination of melamine in milk powder.

melamine；HPLC；milk powder

TS207.3

0254-5071（2016）03-0145-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.033

2015-12-01

邸萬山（1966-），男，副教授，本科，研究方向為工業分析、食品分析與環境分析。