姜黃素對機械通氣相關性肺損傷的保護作用及其機制研究*

張先明，楊　睿，劉　慶，楊文婷，伍偉良，杜　娟△

(1.貴州醫科大學附屬醫院呼吸內科，貴陽 550004；2.貴州省貴陽市第一人民醫院內科　550004；3.廣州醫科大學廣州呼吸疾病研究所，廣州 510000)

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姜黃素對機械通氣相關性肺損傷的保護作用及其機制研究*

張先明1，楊睿2，劉慶1，楊文婷1，伍偉良3，杜娟1△

(1.貴州醫科大學附屬醫院呼吸內科，貴陽 550004；2.貴州省貴陽市第一人民醫院內科550004；3.廣州醫科大學廣州呼吸疾病研究所，廣州 510000)

目的研究姜黃素對機械通氣相關性肺損傷的保護作用及其分子機制。方法將30只健康的日本大耳白兔分為對照組、損傷組和姜黃素組。其中對照組采用正常潮氣量8 mL/kg通氣；損傷組采用20 mL/kg大潮氣量機械通氣誘導肺損傷；姜黃素組在損傷組基礎上給予姜黃素鼻飼，并分別予以血紅素氧合酶1(HO-1)激動劑鈷原卟啉(CoPP)和抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)干預。實驗過程中檢測氧合指數，48 h后處死動物獲取肺組織標本檢測肺組織濕干比(W/D)、丙二醛(MDA)水平及髓過氧化物酶(MPO)活性；用實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RTQ-PCR)法檢測HO-1 mRNA表達水平，比色法檢測其活性，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測肺泡灌洗液(BALF)中腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細胞介素6(IL-6)水平。結果與對照組比較，損傷組氧合指數明顯降低，W/D、MDA水平及MPO活性、肺損傷總積分增加(P<0.05)。姜黃素干預后，姜黃素組氧合指數較損傷組明顯增加，W/D、MDA水平、MPO活性及肺損傷總積分明顯降低；BALF中TNF-α及IL-6水平明顯降低，HO-1活性及mRNA表達水平明顯增加(P<0.05)。姜黃素組經HO-1激動劑CoPP處理后TNF-α、IL-6、肺損傷積分明顯降低；經HO-1抑制劑ZnPP處理后TNF-α、IL-6、肺損傷積分明顯增加。結論姜黃素可能通過上調HO-1表達，從而改善機械通氣相關性肺損傷兔肺部氣體交換功能，減輕炎性反應。

姜黃素；機械通氣相關性肺損傷；血紅素氧合酶-1

姜黃素是從姜黃屬植物中分離出來的一種低分子質量多酚類化合物，其結構為雙阿魏醜甲烷，具有廣泛的作用。隨著對姜黃素研究的日益深入,已證實其具有廣泛的藥理學活性，它不僅可作為一種非甾體類抗炎藥物使用，而且還具有較好的化學預防特性。姜黃素能通過調節多條細胞信號通路[1]，抑制或促進腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等細胞因子的表達[2]，能安全無毒地發揮其抗炎、抗氧化、抗感染、抗腫瘤、抗肺纖維化等廣泛的藥理活性[3]。研究表明姜黃素能通過TGF-1/SMAD3途徑抑制膿毒血癥導致的肺損傷[4]；同時，姜黃素還能通過抑制核因子-κB(NF-κB)及抗氧化作用抑制機械通氣膈肌廢用性萎縮[5]。

最近，有研究還發現姜黃素是血紅素氧合酶1(HO-1)強有力的誘導劑，其抗氧化作用可能主要依賴于誘導HO-1蛋白表達[6-7]。已知 HO-1廣泛表達于細胞微粒體內，是可由多種理化因素誘導的抗氧化酶，它可使細胞內游離血紅素催化降解從而生成膽紅素和CO等[8]，HO-1/膽紅素/CO 系統具有強烈的抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用，是細胞內十分重要的內源性保護體系，與心、肺、腦、腎等多種器官疾病密切相關。誘導 HO-1 高表達對于延緩疾病的進展有重要生物學作用，尤其對組織器官具有重要的保護作用,因而成為目前研究的熱點[9]。機械通氣相關性肺損傷的本質是氣壓傷、剪切傷導致大量炎性介質釋放而形成的生物傷[10]。因此，作者假設姜黃素能夠通過各種分子途徑提高HO-1水平，抑制TNF-α、IL-6等炎性細胞因子釋放，從而達到減輕機械通氣相關性肺損傷的目的。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康清潔級日本大耳白兔30只，月齡3～6月，體質量2.3～3.2 kg,由廣東省高要市實驗動物中心提供。

1.1.2實驗儀器與試劑Evita 4呼吸機(德國德格爾公司)；i-STAT全自動血氣分析儀(美國Abbott公司)；SYBR Premix Ex TaqTM PCR Kit(日本TaKaRa公司)；9600DNA 擴增儀(美國PE生物系統公司)；7500 型實時定量PCR儀( 美國ABI公司)。姜黃素及TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(廣州藍吉生物科技有限公司)；丙二醛(MDA)和髓過氧化物酶(MPO)檢測及反轉錄試劑盒(廣州吉坤生物醫學有限公司)；戊巴比妥鈉、鈷原卟啉(CoPP)和鋅原卟啉(ZnPP,美國Sigma公司)。

1.2方法肌內注射3%戊巴比妥鈉30 mg/kg誘導麻醉后，行氣管切開，插入氣管套管及胃管，分離左側頸總動脈采集動脈血。從耳靜脈滴注乳酸林格液6 mL·kg-1·h-1維持生理需要用以補充喪失的液體并維持血壓穩定。動物準備階段采用容量控制通氣模式(IPPV模式)，潮氣量(VT)8 mL/kg，吸氧分數為50%，吸呼比為1∶2，呼氣末正壓3 cm H2O，根據動脈血氣分析頻率調整呼吸頻率保持動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)在35～40 mm Hg。

1.2.1分組及干預穩定30 min 后記錄各項基礎參數，分為3組。(1)對照組(n=6)：繼續予以初始常規潮氣量8 mL/kg通氣。(2)損傷組(n=6)：大潮氣量20 mL/kg通氣[11]，鼻飼生理鹽水。(3)姜黃素組(n=6)：大潮氣量20 mL/kg通氣，鼻飼姜黃素200 mg/kg，每日3次。為驗證姜黃素是否通過HO-1影響炎性因子及肺損傷，另設兩亞組：姜黃素+CoPP組(n=6)，大潮氣量20 mL/kg，鼻飼姜黃素200 mg/kg，每日3次，并腹腔注射CoPP 15 mg/kg；姜黃素+ZnPP組(n=6)，大潮氣量20 mL/kg，鼻飼姜黃素200 mg/kg，每日3次，并腹腔注射ZnPP 45 mg/kg。

1.2.2血氣分析、肺組織濕干比(W/D)、MDA水平及MPO活性的測定采用i-SATA便攜式血氣分析儀檢測實驗開始及實驗結束時動脈血氧分壓(PaO2)，并根據PaO2/吸入氧濃度(FiO2)計算氧合指數。通過靜脈注射10%氯化鉀(KCl)處死兔，取右肺組織5塊，獲得濕重，80 ℃烤箱內放置24 h，獲取干重，計算W/D。MDA水平按試劑盒說明書的步驟進行：加入樣品及試劑混勻后95 ℃水浴30 min，4 500 r/min離心15 min，測定上清中吸光度(A)值。50 mL磷酸二氫鉀(KH2PO4)加入肺組織后超聲破碎，經過3個凍融循環，4 ℃ 15 000×g離心10 min。20 μL組織上清液與40 μL分析緩沖液混合后，于3 min內在460 nm處檢測MPO的活性。

1.2.3支氣管肺泡灌洗液的采集及細胞因子測定在大耳白兔右主支氣管部位對右肺進行結扎，左肺插管注入30 mL生理鹽水并收集肺泡灌洗液。ELISA法測定TNF-α、IL-6水平。

1.2.4肺組織HO-1活性及HO-1 mRNA的表達HO-1的活性按參考文獻[12]提供的方法進行測定，用考馬斯亮藍法檢測蛋白水平。用Trizol試劑提取肺組織總RNA，反轉錄合成cDNA。HO-1：上游引物5′-CAG GTG ACT GCC GAG GGT TTT -3′，下游引物5′-GGA AGT AGA GCG GGG CGT AG-3′。β-肌動蛋白(β-actin)：上游引物5′-CCC ATC TAC GAG GGC TAC GC-3′，下游引物5′-CAG GAA GGC CTG GAA CA-3′。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳及拍照。每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數以Ct值表示，樣本的相對表達量為2-△△CT。

1.2.5病理學分析通氣48 h后以10%KCl處死動物，取肺組織以10%甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，選取其中4項具有代表意義的病變并積分。包括：肺泡水腫、肺泡出血、肺泡中性粒細胞浸潤、微血栓形成。使用顯微鏡選取病理標本切片四周及中心位置5個互不重疊的視野進行評估。放大100倍,必要時切換至250倍進一步確認。在評分系統中，1～4分代表某一病理特點的嚴重程度：基本正常1分，輕度2分，中度3分，重度4分；每張病理切片每個病理特點5個視野的評分均數代表該病理切片這一病理特點的評分情況。最后用每只實驗兔的5張病理切片均值及所觀察病理特點指標之和來反映整個肺組織的損傷情況。

2　結　　果

2.1各組血氣分析與對照組相比，損傷組氧合指數明顯降低(P<0.01)。姜黃素干預后，姜黃素組氧合指數較損傷組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2各組肺組織中W/D、MDA水平及MPO和HO-1活性的變化損傷組W/D、MDA水平和MPO活性高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。姜黃素干預后，肺組織W/D、MDA水平和MPO活性均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。姜黃素干預后，姜黃素組HO-1活性明顯高于對照組及損傷組。見表1、圖2。

2.3各組肺組織中HO-1 mRNA表達結果顯示，對照組中HO-1 mRNA表達水平低，損傷組表達增加，而給予姜黃素處理后，HO-1 mRNA表達水平明顯增加，見圖3。

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.05,與損傷組比較。

圖1各組血氣分析結果

表1　各組肺組織中MDA水平及MPO和HO-1活性的變化

*：P<0.01,與對照組比較；#：P<0.05，與損傷組比較。

2.4各組細胞因子水平測定與對照組相比，損傷組TNF-α和IL-6水平明顯增加(P<0.05)。姜黃素干預后，姜黃素組TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05)。此外，給予HO-1激動劑CoPP后，TNF-α及IL-6的水平進一步降低，而HO-1抑制劑ZnPP處理后，TNF-α及IL-6的水平明顯增加(P<0.05)，見表2。

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.05,與損傷組比較。

圖2各組W/D的變化

M：標準分子量；1：對照組；2：損傷組；3：姜黃素組。

圖3各組肺組織中HO-1 mRNA相對表達水平

2.5各組肺損傷總積分的對比各組肺泡水腫、肺泡中性粒細胞浸潤、肺泡出血、微血栓形成之間存在明顯差異，損傷組總積分明顯增加(P<0.05)。姜黃素干預后，姜黃素組總積分明顯降低(P<0.05)。此外，給予HO-1激動劑CoPP后，總積分降低，而HO-1抑制劑ZnPP處理后，總積分明顯增加(P<0.05)，見表3。

表2　各組TNF-α和IL-6水平比較

*:P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與損傷組比較；△：P<0.05，與姜黃素組比較。

表3　各組肺損傷總積分的對比±s，n=6)

3　討　　論

機械通氣可以通過一系列機制導致機械通氣相關性肺損傷。機械通氣相關性肺損傷形成的機制主要包括：氣壓傷、容積傷及肺泡反復開閉導致的剪切傷。除直接的結構性損傷外，這些機械力還會促進炎性細胞因子的釋放和中性粒細胞的聚集，導致局部和全身性炎癥增加，形成生物傷，并隨著血液循環將炎癥播散到肺外器官，造成多器官功能衰竭，最終使機械通氣患者病死率增加。

本研究采用大潮氣通氣建立機械通氣相關性肺損傷的動物模型[11]，研究結果顯示，大耳白兔使用大潮氣通氣后，其氧合指數小于300 mm Hg，肺組織W/D、MDA水平和MPO活性的變化，以及炎性介質濃度和肺損傷總積分與對照組差異有統計學意義(P<0.05)，這表明大潮氣量機械通氣可造成機械通氣相關性肺損傷。

近年來，針對機械通氣相關性肺損傷的防治是研究的熱點。姜黃素是從姜黃屬植物中分離出來的一種低相對分子質量多酚類化合物,其結構為雙阿魏醜甲烷。 姜黃素不僅作為一種非甾體類抗炎藥物被使用,而且還具有化學預防特性，被證實具有廣泛的藥理學活性。

本研究顯示，姜黃素組能提高氧合指數，表明姜黃素能有效改善肺組織的氧合和肺換氣功能。同時，姜黃素組W/D下降，表明姜黃素能改善肺微血管的通透性，降低肺水腫的形成。眾所周知，中性粒細胞的聚集在缺血-再灌注損傷中發揮重要的作用，是機械通氣相關性肺損傷中重要的因素之一。因此，抑制中性粒細胞滲出可減輕肺損傷，改善患者的預后[12]。MPO活性是間接評價中性粒細胞滲出的重要指標之一。本研究發現，姜黃素能降低MPO活性，TNF-α、IL-6的水平也下降，提示姜黃素能抑制中性粒細胞的釋放，降低炎性因子水平，從而減輕機械通氣相關性肺損傷。

HO-1在人及哺乳動物組織內廣泛存在,能催化血紅素分解成膽綠素、CO和鐵離子的關鍵限速酶。近年來發現它除了具有降解血紅素功能外,還具有抗炎癥、抗氧化損傷的作用[13],較多的研究表明它具有重要組織器官的保護作用，從而降低重癥患者的多器官功能障礙,因此成為目前研究的熱點之一。在許多病理情況下,如缺血-再灌注時,大量游離血紅蛋白和血紅素產生。當血紅素與體內的氧分子發生反應時,可催化產生大量具有細胞毒性的氧自由基,因而導致DNA 損傷、脂質過氧化及蛋白質變性，加重組織器官的損傷。HO-1作為催化血紅素分解的關鍵限速酶，可降解血紅素,從而產生細胞保護效應[14]。因此，尋求HO-1的誘導劑，對防治各種炎性損傷具有重要意義。本研究表明損傷組HO-1的活性及mRNA表達水平增加，可能是機體正常反饋性保護發揮作用。而經姜黃素處理后，HO-1活性及表達明顯增加，同時分別采用HO-1激動劑CoPP及特異性抑制劑ZnPP處理后，TNF-α、IL-6的水平及肺損傷總積分分別明顯降低及增加，表明誘導HO-1表達后能抑制細胞因子的產生，而特異性抑制HO-1表達能明顯逆轉姜黃素對細胞因子的抑制作用，加重肺損傷，這表明上調HO-1的表達可能是姜黃素抗炎的重要機制之一。

本實驗研究表明，姜黃素能改善氧合，減輕機械通氣相關性肺損傷的肺組織水腫，同時能通過上調HO-1的表達，抑制機械通氣過程中促炎因子的釋放，對機械通氣肺損傷具有一定的肺保護作用。因此，在機械通氣患者腸內營養加入姜黃素，對機械通氣患者可能具有一定的肺保護作用，具有一定的臨床應用價值。

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Protective effect and mechanism of Curcumin on ventilator-induced lung injury in rabbits*

Zhang Xianming1，Yang Rui2，Liu Qing1,Yang Wenting1,Wu Weiliang3，Du Juan1△

(1.Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China;2.Department of Internal Medicine,the First People′s Hospital of Guiyang，Guiyang,Guizhou 550004, China;3.Guangzhou Institute of Respiratory Disease Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510000,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect and molecular mechanism of Curcumin on ventilator-induced lung injury in rabbits.MethodsTotally 30 healthy rabbits were assigned into control group,injury group and Curcumin group.The control group was treated with normal tidal volume 8 mL/kg ventilation;injury group was treated with 20 mL/kg tidal volume mechanical ventilation induced lung injury;on the basic of injury group,Curcumin group was treated with Curcumin,and the heme (HO-1) agonists and inhibitors of heme (CoPP) and zinc porphyrin (ZnPP) inhibitors were administered separately.The oxygenation index was detected,after 48 hours,the animals were sacrificed to obtain lung tissue specimens for detection of lung wet to dry weight ratio (W/D),malondialdehyde (MDA) levels and myeloperoxidase (MPO) activity.The expression level of HO-1 mRNA was detected by RTQ-PCR method,and its activity was detected by colorimetric method,the levels of TNF-α and IL-6 in bronchoalveolar lavage fluid were detected by ELISA.ResultsCompared with the control group,the oxygenation index of injury group was significantly decreased,the W/D ratio,MDA and MPO activity were significantly increased,and the total score of lung injury was also increased(P<0.05).After Curcumin treatment,the oxygenation index increased,the W/D,MDA,MPO and the total score of lung injury decreased significantly (P<0.05).In the Curcumin group,Curcumin decreased the level of TNF-α and IL-6 in BALF,and upregulate HO-1 activity and mNA expression in lung tissue(P<0.05).In addition,in Curcumin group,after treatment with HO-1 agonist CoPP,level of TNF-α and IL-6 in BALF and the total score of lung injury decreased;after treatment with HO-1 inhibitor ZnPP,level of TNF-α and IL-6 in BALF and the total score of lung injury increased.ConclusionCurcumin can induce HO-1 expression,and thus improve gas exchange and decrease inflammatory response and lung injury scores in ventilator-induced lung injury.

curcumin；ventilator-induced lung injury；heme oxygenase-1

貴州省衛生和計劃生育委員會科學技術基金資助項目(gzwjkj2015-1-034)。作者簡介：張先明(1974-)，博士，主要從事呼吸力學及機械通氣的研究。△

，E-mail:dujuan08888@tom.com。

論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.004

R459.7

A

1671-8348(2016)22-3034-04

2016-02-09

2016-04-28)