裸鼠肝癌移植瘤模型體內(nèi)微量蛋白譜分析

于　卉，陶華林，汪碧瓊

(西南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000)

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裸鼠肝癌移植瘤模型體內(nèi)微量蛋白譜分析

于卉，陶華林△，汪碧瓊

(西南醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000)

目的采用Bel-7402人肝癌細(xì)胞懸液接種裸鼠構(gòu)建肝癌裸鼠移植瘤模型，探討模型體內(nèi)微量差異蛋白的表達(dá)情況。方法在裸鼠皮下接種濃度為1×107/mL的肝癌細(xì)胞懸液構(gòu)建腫瘤模型，劑量為每只0.1 mL，對照組接種相同劑量無血清培養(yǎng)液，觀察腫瘤生長情況。在不同時間點(diǎn)取血，用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測分析裸鼠血清中的小分子蛋白。利用Ciphergen ProteinChip 3.0 和 Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)采集和分析，篩選與肝癌相關(guān)的差異蛋白。結(jié)果篩選出115個差異表達(dá)蛋白(P<0.01)，其中有5個差異蛋白表達(dá)規(guī)律性較強(qiáng)，質(zhì)荷比(M/Z)分別為2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da。結(jié)論Bel-7402人肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長過程中能夠表達(dá)與肝癌相關(guān)的微量蛋白質(zhì)，經(jīng)進(jìn)一步蛋白鑒定和試劑開發(fā)可用作肝癌早期診斷的標(biāo)志物。

肝腫瘤；蛋白質(zhì)組學(xué)；表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)；裸鼠模型

近年來肝癌發(fā)病率逐年上升，病因極其復(fù)雜，目前肝癌的診斷主要包括實(shí)驗(yàn)室檢查、影像和超聲等，但這些方法在早期診斷中均有較高的漏診和誤診率，早期病檢又有侵入性損傷，患者難以接受[1-4]。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展較快的一門新技術(shù)，無需樣本純化，可直接檢測血液、尿液、細(xì)胞液等標(biāo)本的微量蛋白，快速、高效[5-11]。本研究采用弱陽離子交換芯片(WCX2)在質(zhì)譜儀上檢測分析了裸鼠肝癌移植瘤模型體內(nèi)的微量蛋白質(zhì)譜圖，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與細(xì)胞株雌性BALB/C裸鼠32只，3周齡，體質(zhì)量12～16 g，購于重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司。Bel-7402人肝癌細(xì)胞株購于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1．2試劑Aμ蛋白芯片(Ciphergen 公司，美國)，新鮮南美胎牛血清和RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，0.25%胰蛋白酶(碧云天生物公司)，促腎上腺皮質(zhì)激素(中科亞光公司)。

1.1.3儀器高速離心機(jī)(安亭科學(xué)儀器廠)，二氧化碳恒溫孵育箱(Thermo公司，美國)，PBSⅡ/C型蛋白指紋圖譜分析儀(Ciphergen 公司，美國)。

1.2方法

1.2.1Bel-7402肝癌細(xì)胞株的培養(yǎng)、傳代肝癌細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后加入RMPI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2的恒溫培育箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，配置成濃度為1×107/mL的癌細(xì)胞懸液[12-14]。

1.2.2裸小鼠接種用乙醇消毒裸鼠的左肩背部皮膚，使用皮試注射器吸取混勻的肝癌細(xì)胞懸液0.1 mL(1×107/mL)，緩慢注射接種于裸鼠左肩背部皮下。對照組裸鼠的接種處理方法與實(shí)驗(yàn)組相同，但接種液為不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)基。

1．2.3裸鼠血清標(biāo)本的收集在移植瘤造模成功后20、40、60 d時用摘眼球法取血，標(biāo)本于30 min內(nèi)存放4 ℃冰箱中靜置1 h，再低溫3 000 r/min離心5 min，將血清分裝于Eppendof管中，每份標(biāo)本分裝3管，置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4微量蛋白譜分析

1.2.4.1標(biāo)本的處理取出待用凍存標(biāo)本，用實(shí)驗(yàn)冰袋低溫溶解后低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min 2 min)。取血清5 μL與PBS緩沖液等體積混勻，取2倍體積(即10 μL)的半飽和SPA溶液加入混合樣品中混勻。

1．2.4.2活化芯片該過程應(yīng)與標(biāo)本的前處理同時進(jìn)行，在芯片上依次加入丙酮溶液、鹽酸溶液、鹽酸甲醇溶液和甲醇溶液各50 μL，每加一種溶液后均需充分振蕩5 min后拍干，在空氣中晾干備用，所有標(biāo)本加樣均控制在10 min內(nèi)完成。

1.2.4.3點(diǎn)樣在活化好的金芯片上，按標(biāo)記順序依次加處理好的待測血清標(biāo)本2 μL，并預(yù)留空白對照，待空氣中晾干后再于每個點(diǎn)上加半飽和SPA溶液1 μL，待自然晾干后即可上機(jī)檢測。

1.2.5數(shù)據(jù)的收集使用PBSⅡ/C 型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀檢測后，通過Ciphergen Proteinchip軟件自動收集數(shù)據(jù)。

2　結(jié)　　果

2.1模型的構(gòu)建接種Bel-7402肝癌細(xì)胞珠的裸鼠，15～20 d后出現(xiàn)明顯腫塊，對照組裸鼠則無明顯異常，見圖1、2。

圖1　對照組裸鼠

圖2　實(shí)驗(yàn)組裸鼠

2.2裸鼠移植瘤腫塊的病理組織學(xué)檢查移植瘤腫塊組織經(jīng)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，其腫塊組織中瘤細(xì)胞異型性明顯，符合肝癌的病理診斷。見圖3。

圖3　病理切片活檢結(jié)果(×100)

2.3兩組微量蛋白檢測結(jié)果對照組和實(shí)驗(yàn)組裸鼠血清經(jīng)上機(jī)檢測，用相關(guān)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正分析后，篩選出115個差異表達(dá)蛋白(P<0.01)，其中表達(dá)規(guī)律性較強(qiáng)的有5個，質(zhì)荷比(M/Z)分別為2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da，尤其前4種微量蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，見表1、圖4。

表1　裸鼠血清微量差異蛋白檢測結(jié)果±s)

圖4　差異蛋白表達(dá)強(qiáng)度與時間的關(guān)系

3　討　　論

在本實(shí)驗(yàn)中通過SELDI-TOF-MS技術(shù)和Biomarker Wizard 3.1軟件檢測分析實(shí)驗(yàn)組和對照組裸鼠血清中的微量蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)有115個差異表達(dá)蛋白，其中有5個微量蛋白表現(xiàn)出較明顯的規(guī)律性變化，肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長過程中，其表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高或者降低的規(guī)律性，這5個微量蛋白的M/Z分別為2 016、3 309、3 442、3 745、2 747 Da，前4個微量蛋白表達(dá)的峰值逐漸增強(qiáng)，后1個微量蛋白表達(dá)的峰值逐漸降低。將5個微量蛋白輸入Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)的蛋白質(zhì)分別是Protein 2A，鉀通道毒素、絲氨酸蛋白酶抑制劑2、神經(jīng)毒素P2、亮氨酸前導(dǎo)反應(yīng)合成肽。它們都具有不同的功能，可能在腫瘤的生長過程中發(fā)揮不同的作用。當(dāng)然這種蛋白的識別具有一定的局限性，如有條件可通過專門機(jī)構(gòu)進(jìn)行蛋白鑒定，并進(jìn)行動物免疫，制備抗體，研發(fā)與微量蛋白相對應(yīng)的檢測方法和試劑，有望用于臨床作為肝癌早期血清標(biāo)志物檢測指標(biāo)。

SELDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)展迅速，盡管已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理想技術(shù)平臺，在各個方面的優(yōu)勢都較明顯，如樣本無需純化、耗時短、標(biāo)本需量少、速度快、大規(guī)模、高通量，但SELDI-TOF-MS技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、儀器配置和實(shí)驗(yàn)操作條件等要求較高[6]。該技術(shù)分析微量蛋白譜時，最好同時設(shè)置內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)，所有標(biāo)本同時檢測，以減少激光衰減，芯片類型等對檢測結(jié)果的影響。

原發(fā)性肝癌的病因與誘因多種多樣如環(huán)境、飲食和水源、吸煙飲酒等生活習(xí)慣，細(xì)菌、病毒和寄生蟲感染亦是誘發(fā)肝癌的可能因素，在不同病因或誘因的情況下可能會導(dǎo)致不同細(xì)胞類型的肝癌，在體內(nèi)表達(dá)的微量蛋白譜也許有差異[9]，而本研究僅僅是作了一株肝癌細(xì)胞，在后續(xù)工作中還需用不同肝癌細(xì)胞株建模，研究體內(nèi)蛋白表達(dá)情況，綜合分析肝癌相關(guān)標(biāo)志物，有利于提高肝癌早期診斷率。

本研究肝癌細(xì)胞在動物造模中采用的是皮下異位造膜，如果用肝癌細(xì)胞原位接種動物構(gòu)建模型，其體內(nèi)蛋白表達(dá)是否與皮下接種造模有差異，是否可用影像學(xué)的方法來觀察原位接種動物模型的腫瘤生長情況及效果，還需進(jìn)一步研究。

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Serum microprotein spectrum analysis in vivo of nude mice with hepatocellular carcinoma

Yu Hui,Tao Hualin△,Wang Biqiong

(Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveWe injected nude mice with human hepatoma cell line (Bel-7402),in order to analyze their serum microprotein spectrum,and so as to find the early diagnosis markers of liver cancer.MethodsWe injected every nude mice with cell suspension (concentration:1×107/mL;dosage:0.1 mL) to built the tumor model,the control group was injected with the same dose of serum free medium.We observed the growth of nude mice and sampled their blood in different time,and then we analyzed the serum microprotein spectrum by SELDI-TOF-MS and screened the proteins related to hepatoma by the embedded software (Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1).ResultsWe got 115 significantly differentiated proteins (P<0.01),and among them,there were 5 proteins expression regularity,M/Z was 2 016,3 309,3 442,3 745,2 747 Da,respectively.ConclusionBel-7402 human liver cells in nude mice in vivo growth process has five proteins have difference,further protein identification and reagent developmentcan open up a new way for early diagnosis of liver cancer.

liver neoplasms;proteomics;SELDI-TOF-MS;nude mice model

于卉(1987-)，主管技師，碩士，主要從事腫瘤蛋白組學(xué)研究。△

，E-mail:lzyxyjyx@163.com。

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.006

R73

A

1671-8348(2016)22-3040-03

2016-02-26

2016-04-02)