激活素A在食管癌組織中的表達(dá)水平及與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

王永連，劉尚國(guó)，陶義鵬，王　毅，王忠民，李漢臣

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科，河南新鄉(xiāng) 453100)

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激活素A在食管癌組織中的表達(dá)水平及與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

王永連，劉尚國(guó)，陶義鵬，王毅，王忠民△，李漢臣

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科，河南新鄉(xiāng) 453100)

目的探討激活素A在食管癌組織中的表達(dá)水平變化，以及與腫瘤分化和轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。方法選取該院2010年6月到2012年6月收治的57例食管癌患者作為研究對(duì)象，同時(shí)選取因食管不適來(lái)院檢查確診無(wú)病變的36例患者作為對(duì)照研究。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)分析食管癌組織和正常食管組織激活素A mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并分析激活素A與食管癌患者腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。結(jié)果食管癌組織中激活素A mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常食管組織(P<0.05)。低分化和中分化食管癌組織中激活素A表達(dá)水平明顯高于正常食管組織和高分化食管癌組織(P<0.05)，低分化食管癌組織中激活素A水平明顯高于中分化(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中激活素A水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。激活素A陽(yáng)性患者術(shù)后1、2、3年累積生存率明顯低于激活素A陰性患者(P<0.05)，而累積復(fù)發(fā)率明顯高于激活素A陰性患者(P<0.05)。結(jié)論食管癌組織中激活素A表達(dá)異常，與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可作為臨床預(yù)后輔助診斷指標(biāo)。

食管腫瘤；腫瘤分化；腫瘤轉(zhuǎn)移；生存和復(fù)發(fā)；激活素A

食管癌是目前世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤類(lèi)型之一，嚴(yán)重影響人類(lèi)的健康[1]。食管癌的發(fā)病具有明顯地域性，在我國(guó)，河南、河北等地是食管癌的高發(fā)地區(qū)。食管癌主要以鱗癌為主，發(fā)病早期臨床癥狀不明顯，因此多數(shù)患者就診時(shí)已經(jīng)為晚期，此外，食管癌的全身轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2-3]。如何早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)并確診食管癌對(duì)于提高患者生存具有重要的意義。但是目前食管癌在臨床上尚無(wú)用于診斷的分子靶標(biāo)。

激活素A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員之一，是一種多功能的細(xì)胞因子，目前發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于人和動(dòng)物的多器官中，在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、心臟形成等諸多生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。近年來(lái)，研究顯示激活素A在腫瘤組織中存在異常表達(dá)，可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及侵襲[7-9]。但是激活素A在食管癌組織中的表達(dá)情況目前研究較少，本研究分析了食管癌組織中激活素A的表達(dá)情況，探討了其與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇本院2010年6月至2012年6月手術(shù)切除的57例食管癌患者的腫瘤組織作為研究對(duì)象(觀察組)，均經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)診斷為食管癌。57例患者中男36例，女21例；年齡44～67歲，平均(50.4±10.4)歲；高分化17例，中度分化25例，低分化15例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，未轉(zhuǎn)移20例；所有患者手術(shù)后隨訪(fǎng)3年。同時(shí)選取36例因食管不適來(lái)本院進(jìn)行身體檢查且食管未見(jiàn)病變的食管病理學(xué)組織作為對(duì)照組。36例患者中男25例，女11例；年齡42～69歲，平均(51.7±11.1)歲。兩組患者在年齡、性別等指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2實(shí)驗(yàn)材料逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×SYBR Green qPCR Master Mix購(gòu)自Takara公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied biosysterm公司；激活素A單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrigen公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自北京試劑公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR食管癌組織或正常食管組織置于1 mL Trizol溶液中，勻漿后加入200 μL氯仿，振蕩混勻后，冰上放置15 min使溶液分層，然后12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至500 μL的異丙醇中，混勻后冰上放置15 min，12 000 r/min離心10 min使RNA沉淀，然后用預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次，最后沉淀溶于DEPC處理的雙蒸水中。測(cè)定樣本濃度，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR的模板。根據(jù)GeneBank提供的激活素A mRNA序列，設(shè)計(jì)如下引物。激活素A-F:5′-TTC TCG CTG TAC TGC TGC AGA-3′，激活素A-R:5′-CTT CCT GCA TGT CTT CAA GAG ATG-3′;β-actin-F:5′-GCG GGA AAT CGT GCG TGA C-3′,β-actin-R:CGT CAT ACT CCT GCT TGC TG-3′。引物稀釋后首先對(duì)引物特異性和退火溫度進(jìn)行條件優(yōu)化。然后按照下述反應(yīng)體系制備反應(yīng)混合物：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10 μL，上游/下游引物各(10 μmmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，補(bǔ)雙蒸水至終體積為20 μL。根據(jù)檢測(cè)樣本的數(shù)量配制相應(yīng)的體積，對(duì)應(yīng)加入PCR板中，每孔20 μL。1 500 r/min離心將反應(yīng)混合物離心至管底，根據(jù)下列反應(yīng)條件進(jìn)行PCR。預(yù)變性：95 ℃,30 s；變性：95 ℃,3 s；退火延伸：60 ℃,30 s；構(gòu)建溶解曲線(xiàn)。最后從實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上直接讀取數(shù)據(jù)。

1.3.2免疫組織化學(xué)石蠟包埋的標(biāo)本組織連續(xù)切成5 μL的薄片，黏附于多聚賴(lài)氨酸處理的玻片上，在50 ℃烘箱中烤1 h，然后依次用二甲苯，100%、95%、80%和75%的乙醇進(jìn)行水化，用蒸餾水洗滌3次。將玻片置于含檸檬酸鈉的緩沖液中，加熱處理8 min，重復(fù)2次，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次；在玻片組織部位滴加3%的過(guò)氧化氫(75%甲醇配制)處理30 min去除內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶。PBS洗滌3次，每次5 min。將稀釋的激活素A一抗按照比例稀釋?zhuān)渭拥讲ＦM織上，4 ℃孵育過(guò)夜，次日PBST洗滌玻片3次，每次5 min；在玻片上滴加10%山羊血清稀釋的羊抗鼠的二抗，室溫孵育1 h后，用磷酸緩沖液(PBST)洗滌3次，每次5 min。在玻片上滴加50 μL的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，邊染色邊在顯微鏡下觀察，染色結(jié)束后用自來(lái)水沖洗，并依此在70%、80%、90%和100%乙醇中脫水，在二甲苯中脫水干燥，并用中性樹(shù)脂固定，在顯微鏡下進(jìn)行固定。

1.4觀察指標(biāo)及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)觀察食管癌組織、正常食管組織中激活素A mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并分析不同分化程度、不同轉(zhuǎn)移患者激活素A的表達(dá)水平，以及與患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)的關(guān)系。激活素A陽(yáng)性患者：免疫組織化學(xué)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)量大于或等于50%；陰性患者：視野中平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞術(shù)小于50%。

2　結(jié)　　果

2.1兩組激活素A mRNA水平比較實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物具有很好的特異性，溶解曲線(xiàn)良好，溶解溫度為83.22 ℃。結(jié)果顯示觀察組組織中激活素A mRNA水平較對(duì)照組顯著性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

A：溶解曲線(xiàn)；B：擴(kuò)增曲線(xiàn)；C：激活素A mRNA水平分析圖。

圖1兩組激活素A mRNA表達(dá)水平比較

2.2兩組激活素A蛋白表達(dá)情況結(jié)果如圖2所示，激活素A主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，免疫組織化學(xué)呈棕色。在對(duì)照組組織中，激活素A蛋白表達(dá)水平較低，而在觀察組中其表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:免疫組織化學(xué)圖(10×20)；B：免疫組織化學(xué)分析圖。

圖2兩組激活素A蛋白表達(dá)比較

2.3不同分化對(duì)食管癌組織激活素A表達(dá)水平的影響定量分析顯示觀察組中中分化和低分化食管癌組織激活素A水平明顯高于高分化和對(duì)照組組織(P<0.05)，低分化明顯高于中分化(P<0.05)，而高分化明顯高于對(duì)照組組織(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4食管癌激活素A水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系本研究57例中37例出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，20例未見(jiàn)轉(zhuǎn)移。以是否存在轉(zhuǎn)移分組，定量分析結(jié)果如圖4所示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者食管癌組織中激活素A表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5食管癌組織激活素A水平與術(shù)后復(fù)發(fā)生存的關(guān)系根據(jù)免疫組織化學(xué)的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，其中激活素A陽(yáng)性38例，陰性19例。激活素A陽(yáng)性患者的術(shù)后12個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月的累計(jì)生存率分別為71.05%、50.00%、21.05%，激活素A陰性患者的術(shù)后12個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月的累積生存率為84.21%、63.16%和36.84%，激活素A陽(yáng)性患者生存率明顯低于陰性患者(P<0.05)。激活素A陽(yáng)性患者術(shù)后12個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月的累積復(fù)發(fā)率分別為23.68%、42.11%和71.00%，激活素A陰性患者術(shù)后12個(gè)月、24個(gè)月和36個(gè)月的累積復(fù)發(fā)率分別為5.26%、21.05%和47.37%，激活素A陽(yáng)性患者累積復(fù)發(fā)率明顯高于陰性的患者(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

A：不同分化的免疫組織化學(xué)圖(10×20)；B：不同分化的免疫組織化學(xué)分析圖。

圖3不同分化對(duì)食管癌組織激活素A表達(dá)水平的影響

圖4　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未轉(zhuǎn)移患者食管癌組織中激活素A表達(dá)水平比較

圖5　激活素A陽(yáng)性和陰性患者術(shù)后情況比較

3　討　　論

激活素A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族球蛋白成員之一，是一種由性腺分泌的大分子糖蛋白，其最早在雌豬卵泡液中被分離出來(lái)。激活素A有3種不同類(lèi)型的受體，其可在Ⅲ型受體的輔助下，與Ⅱ型受體結(jié)合，然后磷酸化Ⅰ型受體，并與磷酸化的ActR Ⅰ形成三元絡(luò)合物，再使胞漿內(nèi)的Smad2和Smad3磷酸化，最后將信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，并在細(xì)胞核中調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)[10-11]。正常的激活素A在維持細(xì)胞增殖、黏附、凋亡及分化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[12-14]。但是近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，在諸多的腫瘤組織中激活素A表達(dá)水平顯著性增加，并參與了腫瘤的進(jìn)展、侵襲等行為，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[15-16]。

食管癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤類(lèi)型之一，激活素A是否在食管癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著一定作用，有報(bào)道顯示激活素A在食管癌患者血清中表達(dá)水平呈現(xiàn)異常[17]。但是這方面報(bào)道較少，缺乏普遍性。因此，本研究首先分析了正常食管和食管癌組織中激活素A mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示食管癌組織中激活素A mRNA和蛋白水平較正常食管組織顯著性升高，說(shuō)明激活素A在食管癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。這一結(jié)果與目前報(bào)道結(jié)果一致。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，低分化中激活素A表達(dá)水平最高，中分化次之，而高分化最低，提示激活素A表達(dá)與腫瘤分化程度存在相關(guān)性。以患者是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為標(biāo)準(zhǔn)分類(lèi)研究顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者激活素A的表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者，說(shuō)明激活素A可能參與了食管癌的轉(zhuǎn)移發(fā)生。這一結(jié)果在其他腫瘤類(lèi)型中已得到了證實(shí)。手術(shù)治療是食管癌治療的主要方法，但是部分患者術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，進(jìn)而嚴(yán)重影響了生存時(shí)間。本研究顯示激活素A陽(yáng)性患者累積生存率明顯低于激活素A陰性患者，而累積復(fù)發(fā)率明顯高于激活素A陰性患者，這一結(jié)果說(shuō)明激活素A表達(dá)水平與患者術(shù)后生存和復(fù)發(fā)有著密切關(guān)系。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的主要的原因可能是激活素A一般高表達(dá)與低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，這些患者腫瘤惡性程度高，術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)較大。

綜上所述，激活素A在食管癌組織中表達(dá)異常，并與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移情況及術(shù)后生存和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，有望成為食管癌患者術(shù)后預(yù)后診斷標(biāo)志。

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The expression levels of activin A in esophageal cancer and its relationship with tumor differentiation and metastasis*

Wang Yonglian,Liu Shangguo，Tao Yipeng,Wang Yi,Wang Zhongmin△,Li Hanchen

(Department of Thoracic Surgery,the First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University,Xinxiang,Henan 453100,China)

ObjectiveTo investigate the changes of activin A expression levels in esophageal carcinoma and its relationship with tumor differentiation and metastasis.MethodsTotally 57 cases of esophageal cancer patients from June 2010 to June 2012 in our hospital were selected as research subjects,while 36 patients that esophageal discomfort and diagnosed without lesions were selected as a control study.Activin A mRNA and protein expression level were analyzed by real-time PCR and immunohistochemistry.The relationship between activin A and tumor differentiation,metastasis,survival and recurrence were analyzed.ResultsThe expression level of activin A mRNA and protein th in observation group significantly enhanced than that of normal esophageal tissues(P<0.05).The activin A levels in poorly and moderately differentiated esophageal tissue were significant higher than that of well-differentiated(P<0.05).The activin A levels in poorly differentiated esophageal tissue expression of were significant higher than that of and moderately differentiated esophageal tissue(P<0.05).There was positive correlation between differentiation degree and activin A expression levels.The activin A levels in patients with lymph node metastasis were were significantly higher than those without metastasis(P<0.05).1,2 and 3 year cumulative survival rate in high expression of activin patients was significantly lower than that of low expression of activin A(P<0.05).1,2 and 3 year cumulative recurrence rate in high expression of activin patients was significantly higher than that of low expression of activin A(P<0.05).ConclusionThe activin A in esophageal cancer tissue exhibit abnormal level.There are closely relationship between activin A and tumor differentiation,metastasis and postoperative survival and recurrence rates,can be used as a diagnostic marker of clinical outcomes.

esophageal neoplasms;tumor differentiation;neoplasm metastasis;survival and recurrence;activin A

河南省衛(wèi)生廳立項(xiàng)課題(200803080)。作者簡(jiǎn)介：王永連(1973-)，副主任醫(yī)師,碩士,主要從事胸外科工作。△

，E-mail:wangyonglian777@163.com。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.007

R735.1

A

1671-8348(2016)22-3043-03

2016-02-19

2016-03-26)