高濃度氧對腺肌癥細胞生長及HIF-1α表達的影響

朱紹密，黃　璐，段　霜

(四川省成都市婦女兒童中心醫院婦產科　610000)

?

高濃度氧對腺肌癥細胞生長及HIF-1α表達的影響

朱紹密，黃璐，段霜

(四川省成都市婦女兒童中心醫院婦產科610000)

目的探討高濃度氧對腺肌癥細胞生長及細胞內缺氧誘導因子1α(HIF-1α)表達的影響。方法將標本分為高氧組和對照組，原代培養腺肌癥細胞，繪制生長曲線，檢測細胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力及培養液中丙二醛(MDA)的水平。細胞免疫組織化學檢測腺肌癥細胞內HIF-1α的表達。結果高濃度氧使腺肌癥細胞生長速度減慢，8 h后呈抑制狀態。在相同培養時間內，高氧組腺肌癥細胞SOD活力低于對照組，MDA水平高于對照組(P<0.05)。隨著高濃度氧持續時間的延長，HIF-1α在腺肌癥細胞中表達呈下降趨勢。結論高濃度氧可能對子宮腺肌癥中新生血管的生成產生抑制。

缺氧誘導因子1；超氧化物歧化酶；丙二醛；子宮腺肌癥

子宮腺肌癥是指子宮內膜向子宮肌壁侵入生長的病理過程，多發于40歲以上經產婦，該病發病機制不明，主要臨床表現為繼發性痛經、經期延長、月經量過多等[1]。該病近年來發病率有上升趨勢，且逐漸趨于年輕化[2]。藥物及保守手術治療效果不理想，有效治療仍以子宮全切為主，這對渴望生育的婦女臨床治療非常棘手，因此探討子宮腺肌癥分子水平的治療成為子宮腺肌癥研究的熱點課題。異位病灶在子宮肌層生長必須有新生血管供血。因此,血管形成在腺肌癥發病中具有重要作用[3]。血管生成不僅受低氧環境的影響，還與促血管生成因子有密切的關系,而血管生成因子的表達受許多外部因子調控，其中缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)對其調控最為顯著[4]。研究表明，低氧環境下HIF-1α能誘導微血管生成，增加組織無氧代謝，從而增強內膜細胞的侵襲能力[5]。本研究采用原代細胞培養及免疫組織化學的方法，通過檢測氧化指標丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)，探討高濃度氧(95%O2+5% CO2)對腺肌癥病灶中異位內膜細胞活性及細胞內HIF-1α表達的影響。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年8月 至2015年3月在成都市婦女兒童中心醫院婦產科因子宮腺肌癥行子宮全切術的患者30例，平均年齡(42.4±3.4)歲。所選病例術前3個月未接受激素治療。收集的標本分為兩部分，一部分送病檢，由有經驗的病理科醫師閱片，明確病理診斷，并排除惡性病變。一部分放入DMEM培養基中，置冰上，立即轉運到實驗室，進行細胞消化，原代培養。

1.2方法

1.2.1主要試劑DMEM培養基，胎牛血清(FBS)為美國Gibco公司產品，膠原酶Ⅲ，四甲基偶氮唑鹽(MTT)為美國Sigma公司產品，兔抗人HIF-1α單克隆抗體為美國Abcam公司產品，SOD及MDA測試盒均為南京建成生物公司產品。

1.2.2腺肌癥細胞的原代培養在超凈工作臺內，將腺肌癥組織剪成1 mm3小塊，D-Hanks液反復沖洗后加入Ⅲ型膠原酶，DMEM培養基，使消化酶最終濃度為2 mg/mL；37 ℃恒溫水浴箱振蕩消化7 h。加入等體積10%FBS終止消化。將腺肌癥細胞懸液以2×106/mL密度種植于6孔板。

1.2.3分組將原代培養的腺肌癥細胞分為兩組，培養于不同的氣體環境中。高氧組，95%氧氣+5%的CO2；對照組，95%空氣+5%的CO2。MTT法分別檢測兩組細胞活力，并繪制生長曲線。

1.2.4細胞爬片及HIF-1α的檢測將腺肌癥細胞懸液以1×106/mL密度種植于細胞專用爬片，高濃度氧培養后，參考試劑盒步驟SP法檢測細胞內干預前及干預后4、8 h HIF-1α蛋白的表達變化。免疫組織化學陽性判斷標準：HIF-1α陽性信號為腺肌癥細胞胞質中出現棕黃色顆粒，通過Imageproplus圖像分析軟件高倍視下選擇10個視野測定每張切片中陽性細胞的平均光密度(MOD)代表蛋白表達量。

1.2.5SOD活力、MDA水平檢測腺肌癥細胞經高濃度氧環境培養，干預前及干預后4、8 h細胞內SOD及MDA的檢測均參照試劑盒步驟。

2　結　　果

2.1兩組腺肌癥細胞生長曲線比較腺肌癥細胞在高濃度氧狀態下緩慢增殖，隨時間的增加，差距逐漸增大，生長速度明顯小于對照組(P<0.05)。8 h后，高氧組細胞呈明顯生長抑制狀態,見圖1。

圖1　兩組腺肌癥細胞生長曲線

2.2兩組腺肌癥細胞中SOD活力比較對照組腺肌癥細胞在各時間點SOD活力差異無統計學意義(P>0.05)。在相同培養時間內，高氧組腺肌癥細胞SOD活力明顯低于對照組(P<0.05)。在高濃度氧環境下，隨著時間的延長，腺肌癥細胞內SOD活力呈下降趨勢，見表1。

2.3兩組腺肌癥細胞培養液中MDA水平比較對照組內在各時間點腺肌癥細胞培養液中MDA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。在相同培養時間內，高氧組細胞培養液中MDA水平明顯高于對照組(P<0.05)。在高濃度氧環境下，隨著時間的延長，細胞培養液內MDA水平呈上升趨勢,見表2。

表1　兩組腺肌癥細胞中SOD活力對比

a：P<0.05,與對照組比較。

表2　兩組細胞培養液中MDA水平比較

a:P<0.05，與對照組比較。

2.4高濃度氧對腺肌癥細胞內HIF-1α蛋白表達的影響HIF-1α在腺肌癥細胞爬片中陽性染色主要定位于細胞核，呈現棕黃色顆粒。隨著高濃度氧持續時間的延長，HIF-1α在腺肌癥細胞中表達總體上呈下降趨勢(圖2)。0、4、8 h HIF-1α蛋白分別為0.189±0.025、0.142±0.013、0.079±0.012，8 h明顯低于4 h，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2　HIF-1α在腺肌癥細胞中的表達(×400)

3　討　　論

高濃度氧產生大量自由基攻擊生物膜中的多個不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物，包括MDA、脂自由基 L·、烷自由基 R·等。這些產物性質穩定且壽命長，可蔓延而發生連鎖反應，造成更嚴重的損傷[6]。生命的進化使細胞發展了有效的抗氧化防御機制。以SOD為代表的抗氧化酶是一個最重要的防御體系，以自由基為底物催化歧化反應，清除體內氧自由基及MDA等產物，保護細胞[7]。MDA生成能刺激抗氧化防御機制增高活性以對抗其傷害，但是MDA一旦生成過量細胞還是會受到損傷，過度損傷的細胞將通過凋亡機制被清除[8]。本研究中，腺肌癥細胞在高濃度氧環境中的生長活力相對于對照組受到明顯的抑制，隨著高濃度氧培養時間的延長，細胞發生凋亡，活力明顯下降，與上述理論相符。本研究的后續實驗探索了這一現象的原因，結果發現，腺肌癥細胞在高濃度氧環境中生長，培養液中的脂質過氧化產物MDA水平明顯高于對照組，呈時間-劑量累積效應。相反，長時間的高濃度氧培養，破壞了腺肌癥細胞的抗氧化防御機制，使得抗氧化酶SOD活力逐漸降低，最終失去對細胞的保護，致其生長受到抑制，甚至死亡。根據本研究結果，高濃度氧可抑制腺肌癥細胞的生長，為臨床醫療中，可否對子宮腺肌癥病灶進行局部高濃度氧治療的探索提供新的方向有待深入研究。

研究發現缺氧環境能夠調節子宮內膜血管內皮生長因子大量分泌,促進大量新生血管的形成可能是腺肌癥的發病機制之一[9]。血管生成是子宮內膜異位癥發生、發展的基礎,血管生成有賴于血管生長因子的調控[10]。HIF-1α是在缺氧條件下存在于哺乳動物及人體內的一種轉錄因子，它是低氧應答的全局性調控因子，可在上游基因水平調控血管內皮生長因子等多種血管生成相關因子的表達直接參與血管生成的調控。其功能不僅使血管內皮生長因子的mRNA穩定性增加,而且能增加血管內皮生長因子的轉錄活性[11]。因此，將下調HIF-1α的活性，減少其在腺肌癥中的表達，進而減少新生血管，減少其轉移和侵襲作為治療的切入點，已經成為目前探索腺肌癥分子治療的熱點。Zhong等[12]報道強氧化劑不利于HIF-1α在低氧細胞的表達及其DNA結合活性。本研究中發現，通過高濃度氧改變腺肌癥細胞的乏氧狀態，細胞中HIF-1α蛋白的表達明顯下降，且隨著時間的延長，HIF-1α持續下降趨勢，與前述研究結果相符。HIF-1α是氧感受家族中的管家轉錄因子，在常氧下極不穩定，可經泛素蛋白酶解通路迅速被降解，而缺氧則抑制其降解，使 HIF-1α 表達增強，并通過激活一系列靶基因的轉錄，使細胞獲得對組織低氧和營養物質供應減少的適應能力，維持細胞的生存與增殖[13]。本研究將腺肌癥細胞持續高濃度氧刺激，一方面利用氧自由基對細胞本身的損害減少HIF-1α的表達，另一方面使持續高濃度氧狀態降低HIF-1α的穩定性，使其降解。而高濃度氧降低HIF-1α表達最主要的機制，是利用持續高濃度氧提高腺肌癥細胞生長環境的氧分壓,使乏氧細胞轉變為富氧細胞，減少低濃度氧環境對細胞的刺激，降低HIF-1α的表達，相應降低HIF-1α轉錄的一系列因子，減少腺肌癥細胞的生長[14]。

綜上所述，高濃度氧可損傷腺肌癥細胞，并抑制其生長，通過減少細胞中HIF-1α的表達，可能對病灶中新生血管的生成產生抑制。通過高濃度氧來抑制腺肌癥病灶的生長和侵襲，在國內外的研究中尚處于新興階段，但已經有一些基礎實驗證明了這條途徑的可能性。本研究從細胞水平進一步證明了高濃度氧對腺肌癥病灶的抑制，為臨床研究中，探索腺肌癥非手術治療提供新的思路。尤其針對育齡期腺肌癥患者保留生育力的治療研究提供了理論基礎。

[1] Taran F,Stewart E,Brucker S.Adenomyosis:epidemiology,risk factors,clinical phenotype and surgical and interventional alternatives to hysterectomy[J].Geburtshilfe Frauenheilkd,2013,73(9):924-931.

[2] 張穎，段華.子宮內膜-肌層交界區的生理功能與相關疾病[J].華婦產科雜志,2009,44(11):876-878.

[3] Zhou S,Yi T,Liu R,et al.Proteomics identification of annexin A2 as a key mediator in the metastasis and proangiogenesis of endometrial cells in human adenomyosis[J].Mol Cell Proteomics,2012,11(7):715-720.

[4] Goteri G,Lucarini G,Montik N,et al.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF),hypoxia inducible factor-1alpha(HIF-1alpha),and microvessel density in endometrial tissue in women with adenomyosis [J].Int J Gynecol Pathol,2009,28(2):157-163.

[5] Ahn G,Seita J,Hong B,et al.Transcriptional activation of hypoxia-inducible factor-1(HIF-1) in myeloid cells promotes angiogenesis through VEGF and S100A8[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111(7):2698-2703.

[6] Wang J,Jiang C,Alattar M,et al.Oxidative injury induced by cadmium sulfide nanoparticles in A549 cells and rat lungs[J].Inhal Toxicol,2015,25(5):1-10.

[7] Holley AK,Dhar SK,Xu Y,et al.Manganese superoxide dismutase:beyond life and death [J].Amino Acids,2012,42(1):139-158.

[8] Yasmeen H,Hasnain S.In vitro antioxidant effect of Camellia sinensis on human cell cultures[J].Pak J Pharm Sci,2015,28(5):1573-1581.

[9] Huang T,Chen Y,Chou T,et al.Oestrogen-induced angiogenesis promotes adenomyosis by activating the Slug-VEGF axis in endometrial epithelial cells[J].J Cell Mol Med,2014,18(7):1358-1371.

[10] Riddell J,Maier P,Sass S,et al.Peroxiredoxin 1 stimulates endothelial cell expression of VEGF via TLR4 dependent activation of HIF-1α [J].PLoS One，2012,7(11):e50394.

[11] Cammarata PR,Neelam S,Brooks MM.Inhibition of hypoxia inducible factor-1α downregulates the expression of epithelial to mesenchymal transition early marker proteins without undermining cell survival in hypoxic lens epithelial cells[J].Mol Vis,2015,9(1):1024-1035.

[12] Zhong H,Marzo AM,Laughner E,et al.Overexpression of hypoxia-inducible factor-1alpha in common human cancers and their metastases[J].Cancer Res,1999,59(6):5830-5835.

[13] Feast A,Martinian L,Liu J,et al.Investigation of hypoxia-inducible factor-1α in hippocampal sclerosis:A postmortem study[J].Epilepsia,2012,53(8):1349-1359.

[14] Sun L,Marti HH,Veltkamp R.Hyperbaric oxygen reduces tissue hypoxia and hypoxia-inducible factor-1 alpha expression in focal cerebral ischemia[J].Stroke,2008,39(3):1000-1006.

The effect of hyperoxia on the growth of adenomyotic cells and expression of HIF-1α

Zhu Shaomi,Huang Lu,Duan Shuang

(Department of Obstetrics and Gynecology Chengdu Women and Children Center Hospital,Chengdu,Sichuan 610000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of hyperoxia on the growth of adenomyotic cells and expression of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α).MethodsAdenomyotic cells were cultured in hyperoxia group and the control group,and the cell growth curve were drawed.Superoxide dismutase(SOD) in adenomyotic cells and malondialdehyde(MDA) in the culture medium were detected.The expression of HIF-1α was detected by immunocellchemistry.ResultsThe growth rate of adenomyotic cells was slowed down by hyperoxia,which was suppressed after 8 hours.During the same time of culture,adenomyotic cells in hyperoxia group showed lower SOD and higher level of MDA when compared with that in control group(P<0.05).Hyperoxia down-regulated the expression of HIF-1α in adenomyotic cells.ConclusionHyperoxia may inhibit the formation of new blood vessels in the uterine glands.

hypoxia-inducible factor1;superoxide dismutase;malondialdehyde；adenomyosis

朱紹密(1982-)，主治醫師，博士，主要從事婦產科工作。

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.018

R711

A

1671-8348(2016)22-3075-03

2016-03-26

2016-05-14)