食管癌易感基因C20orf54的生物信息學分析*

黃志剛，洪秋娜，陳婷婷，李戈楠，何　臻，倫嘉欣，林　婉，賴玉仙，楊　威，鄧俏蓮

(廣東醫學院公共衛生學院東莞市環境醫學重點實驗室，廣東東莞 523808)

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食管癌易感基因C20orf54的生物信息學分析*

黃志剛，洪秋娜#，陳婷婷，李戈楠，何臻，倫嘉欣，林婉，賴玉仙，楊威，鄧俏蓮

(廣東醫學院公共衛生學院東莞市環境醫學重點實驗室，廣東東莞 523808)

目的利用生物信息學方法對食管癌易感新基因C20orf54進行特征分析和功能預測，以獲得該基因及其編碼蛋白更多的功能提示。方法應用Blat、Blast、ProtParam、SOPMA、ScanProsite、SignalP4.1、TMHMM、PSORT和UniGene等軟件或數據庫,進行染色體定位、序列的相似性比較、理化性質、二級結構、亞細胞定位、功能位點識別。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)，驗證C20orf54基因在食管癌細胞和鼻咽癌細胞中的表達情況。結果C20orf54基因進化保守，蛋白質不穩定，具有疏水性，定位于細胞膜的可能性最高，序列中預測有蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和N-糖基化位點及N-豆蔻酰化位點。二級結構主要是α螺旋和無規則卷曲。C20orf54基因可在食管癌細胞和鼻咽癌細胞中表達。結論人類C20orf54蛋白是定位于細胞膜上的不穩定疏水蛋白，可能在體內參與多種生物學過程，但可能并不是在食管癌組織特異表達的分子標志。

食管腫瘤；生物信息學；C20orf54

食管鱗狀細胞癌(簡稱食管癌)是全世界十大惡性腫瘤之一，具有特定區域高發的特點。世界上食管癌發病率和病死率最高的地區集中在我國的河南、河北和山西三省交界的太行山地區，食管癌仍是這些地區腫瘤相關死亡的主要原因[1]。盡管普遍認為食管癌的發生是由環境、遺傳等多種因素綜合作用的結果，但其致癌的分子機制至今未明。新近的全基因組關聯研究(GWAS)在鑒定復雜性疾病易感基因方面取得的成就，為揭示食管癌的發病機制提供了重要證據。以我國人群為基礎的食管癌GWAS發現，核黃素轉運基因又稱C20orf54基因的rs13042395位點是食管癌的易感位點，C20orf54成為新的食管癌易感基因而備受研究者重視[2]。

目前已有多篇文獻報道了C20orf54基因的功能性遺傳變異與食管癌的發生有關[3-5]，但也有兩項獨立的研究認為C20orf54基因與食管癌無關[6-7]。因此，C20orf54基因的生物學功能是什么，其在食管癌的發生、發展過程中發揮什么作用等問題，亟待進一步研究解決。本研究利用生物信息學方法對C20orf54基因及其編碼的蛋白進行了分析和功能預測，并觀察C20orf54基因在不同上皮細胞內的表達情況，為進一步深入研究C20orf54基因的生物學功能提供參考依據。

1　材料與方法

1.1基因組定位及外顯子分析用UCSC Genome Bioinformatics 的Blat數據庫進行基因組定位及外顯子分析(http:// genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)。

1.2序列比對利用NCBI的Blastn程序進行C20orf54基因的核苷酸序列同源性分析；用BlastP程序進行氨基酸同源性對比(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.3理化性質分析利用ExPASy 的ProtParam Tool 軟件(http://web.expasy.org/protparam)預測等電點、分子量、疏水性、電荷分布等。

1.4蛋白質結構預測利用SOPMA程序(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)分析C20orf54蛋白的二級結構；利用ExPASy 的ScanProsite tool工具(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)預測蛋白質的功能性位點；信號肽剪切位點利用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測；TMHMM程序預測跨膜信息(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；保守結構域及其功能用NCBI/CDD預測。

1.5亞細胞定位分析利用PSORT (http://psort.hgc.jp/form2.html) 進行亞細胞定位預測。

1.6RT-PCR擴增C20orf54基因編碼區Trizol法提取食管癌細胞(ECA109)、鼻咽癌細胞(CNE-2Z)總RNA，按逆轉錄試劑盒(QIAGEN)操作步驟進行逆轉錄。以cDNA為模板，擴增C20orf54 基因編碼區序列，上游引物：5′-ATG GCC TTC CTG ATG CAC C-3′，下游引物：5′-CTA GGC TGG ACA GTG CAG AT-3′。擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s,58 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將擴增產物送上海立菲生物技術有限公司(廣州分公司)測序，并將序列登錄GenBank數據庫。

2　結　　果

2.1基因組定位及外顯子分析將C20orf54基因序列(NM_033409)與人類基因組草圖庫進行比對,該cDNA 序列定位于20號染色體740,724～749,228區域(20p13)，基因組跨越8,505 bp。外顯子分析發現，C20orf54基因由5個外顯子和4個內含子所組成，內含子和外顯子交界區均符合AG-GT規則。

2.2序列比對結果經BLASTn在nr核苷酸序列數據庫在線同源性分析C20orf54基因序列，發現人與大猩猩、長臂猿、恒河猴等靈長類哺乳動物的相似性在95%以上，其中大猩猩最高達98%；而人與狼犬、家貓、虎鯨及小鼠等物種的相似性分別為85%、85%、85%和83%。經對C20orf54的多物種氨基酸序列相似性比較發現，人與大猩猩、黑長臂猿的相似性最高達到99%，與松鼠猴、狨毛猴的相似性為94%，與家豚鼠、狼犬、海豚、小鼠和青將魚的相似性分別為84%、82%、81%、74%和47%。C20orf54蛋白的氨基酸組成在脊椎動物中保守性較高。

2.3C20orf54蛋白的理化性質C20orf54基因編碼的蛋白質氨基酸長度為469 aa，相對分子質量為50 805.1，理論等電點為5.46，pH7.0時帶負電荷(-10.947)。該蛋白質的半衰期在哺乳動物網織紅細胞中為30 h，在酵母體內超過20 h，大腸桿菌體內可超過10 h；不穩定指數為43.92(>40為不穩定)，屬于不穩定蛋白質；脂肪指數為119.06，總體平均親水值為0.882，屬于疏水蛋白質。

2.4蛋白質結構預測及亞細胞定位分析C20orf54蛋白二級結構預測發現，含α螺旋(Hh)36.46%，β折疊(Tt)5.12%，延伸鏈(Ee)和無規則卷曲(Cc)分別占15.35%、43.07%。 ScanProsite tool工具尋找蛋白質的功能性位點，結果發現在該蛋白質氨基酸序列中存在1個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、3個N-糖基化位點及10個N-豆蔻酰化位點，未發現其他基序及保守結構域存在。TMHMM程序預測C20orf54蛋白可能存在11個跨膜區域，N末端在膜內的概率為99.621%。亞細胞定位分析認為，C20orf54蛋白在細胞膜表達的可能性最高(73.9%)，其次為內質網(21.7%)和線粒體(4.3%)。而SignalP4.1未預測出信號肽剪切位點。

2.5RT-PCR結果本研究選擇食管癌(ECA109)和鼻咽癌(CNE-2Z)兩種細胞株，抽提細胞總RNA，進行RT-PCR，發現均可擴增出約1 400 bp的C20orf54基因編碼區片段。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1、2。測序證實擴增片段與C20orf54基因編碼區序列一致。

1：LD2000 Marker；2：擴增產物。

圖1食管癌細胞ECA109擴增結果

1：LD2000 Marker；2：擴增產物。

圖2鼻咽癌細胞CNE-2Z擴增結果

3　討　　論

食管癌GWAS發現，C20orf54基因rs13042395位點的遺傳變異與食管癌有關，C20orf54基因作為新的食管癌易感基因成為研究熱門[2]。C20orf54是人類核黃素轉運基因，該基因定位于20p13，其編碼產物為核黃素轉運蛋白。目前，人類核黃素轉運蛋白的生物學功能尚未闡明，因其與鼠核黃素轉運蛋白有83%的相似性，所以推測人類核黃素轉運蛋白與鼠相似，在小腸和結腸中高表達，在腸組織對核黃素的吸收中發揮重要作用[8]。

利用Blast程序在多個物種內發現與人C20orf54蛋白相似的序列,其相似度從高等靈長類動物大猩猩、類人猿到海洋哺乳動物海豚、從嚙齒類動物小鼠到低等脊椎動物青將魚等依次降低。說明人C20orf54基因進化上相對保守，其可能參與基本生物學過程。對C20orf54蛋白質的二級結構預測發現，其肽鏈上α螺旋和無規則卷曲水平較高，表明該蛋白具有較好的可塑性。理化性質分析發現，C20orf54蛋白是不穩定的疏水蛋白質，可能定位在細胞膜上(73.9%)，發揮其多種生物學作用。C20orf54蛋白可能存在11個跨膜區域，而跨膜結構多構成受體、通道，執行信號傳導等重要功能[9-10]。

對C20orf54蛋白進行功能性位點分析發現，其氨基酸序列中存在蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-糖基化位點及N-豆蔻酰化位點。蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點是信號傳導調控中的常見分子結構，在細胞增殖及細胞周期中有著廣泛的調節作用[11]。N-糖基化位點是蛋白質糖基化修飾的識別位點，蛋白質的糖基化修飾使糖鏈與糖結合蛋白相互作用，參與眾多生理或病理過程，也可以作為微生物和有毒物質的結合位點。蛋白質的糖基化修飾是生物體調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后方式[12]。而豆蔻酰化位點可參與細胞生長發育、信號傳導和腫瘤發生等重要生理過程。由于蛋白質結構特異性識別相關分子是其行使功能的關鍵，故該蛋白可能通過磷酸化、糖基化及豆蔻酰化而發揮多種重要的生物學作用。

本研究發現，食管癌(ECA109)和鼻咽癌(CNE-2Z)均可擴增出約1 400 bp的片段，經測序證實與C20orf54基因編碼區序列一致，說明C20orf54基因在食管癌及鼻咽癌細胞中均是有表達，C20orf54基因可能不是在食管癌組織特異表達的分子標志。

在發現C20orf54基因與食管癌的關系之前，已有多篇報道認為，C20orf54基因突變與Brown-Vialetto-Van Laere綜合征(BVVLS)有關。BVVLS是一種罕見的以進行性橋延麻痹伴有耳聾為特點的神經障礙疾病。目前認為，C20orf54基因突變是導致BVVLS發生的重要致病因素，盡管其具體致病機制尚不清楚[13-16]。可見，人類C20orf54基因可能在體內多種生理、病理過程中發揮作用，有必要對其進行更深入的研究。本文通過生物信息學分析初步揭示了人類食管癌新易感基因C20orf54及其編碼產物的基本特性，為進一步開展C20orf54基因的功能和相關分子機制研究奠定了基礎。

[1]鄒小農．食管癌流行病學[J]．中華腫瘤防治雜志，2006，13(18)：1445-1448．

[2]Wang LD,Zhou FY,Li XM,et al.Genome-wide association study of esophageal squamous cell carcinoma in Chinese subjects identifies susceptibility loci at PLCE1 and C20orf54[J].Nat Genet,2010,42(9):759-763.

[3]Wei W,Ji A,Wang J,et al.Functional single nucleotide polymorphism in C20orf54 modifies susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma[J].Dis Esophagus,2013,26(1):97-103.

[4]Ji A,Wang J,Yang J,et al.Functional SNPs in human C20orf54 gene influence susceptibility to esophageal squamous cell carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(12):3207-3212.

[5]紀愛芳，魏武，楊建洲，等．核黃素轉運蛋白基因位點單核苷酸多態性與食管鱗癌遺傳易感性的關系[J]．中華內科雜志，2012，51(12)：982-986．

[6]Palmer AJ,Lochhead P,Hold GL,et al.Genetic variation in C20orf54,PLCE1 and MUC1 and the risk of upper gastrointestinal cancers in Caucasian populations[J].Eur J Cancer Prevention,2012,21(6):541-544.

[7]Gu H,Ding G,Zhang W,et al.Replication study of PLCE1 and C20orf54 polymorphism and risk of esophageal cancer in a Chinese population[J].Mol Biol Rep,2012,39(9):9105-9111.

[8]Yamamoto S,Inoue K,Ohta KY,et al.Identification and functional characterization of rat riboflavin transporter 2[J].J Biochem,2009,145(4):437-443.

[9]Breton G,Danyluk J,Charron JB,et al.Expression profiling and bioinformatic analyses of a novel stress-regulated multispanning transmembrane protein family from cereals and Arabidopsis[J].Plant Physiol,2003,132(1):64-74.

[10]White SH,Von Heijne G.Transmembrane helices before,during,and after insertion[J].Curr Opin Struct Biol,2005,15(4):378-386.

[11]姜錚，王芳，何湘，等．蛋白質磷酸化修飾的研究進展[J]．生物技術通訊，2009，20(2)：233-237．

[12]周蕾，顧建新．N-糖基化位點鑒定方法和非經典N-糖基化序列[J]．生命科學，2011，23(6)：605-611．

[13]Bandettini Di Poggio M,Gagliardi S,Pardini M,et al.A novel compound heterozygous mutation of C20orf54 gene associated with Brown-Vialetto-Van Laere syndrome in an Italian family[J].Eur J Neurol,2013,20(7):e94-95.

[14]Houlden H.A commentary on four novel C20ORF54 mutations identified in Brown-Vialetto-Van laere syndrome patients[J].J Hum Genet,2012,57(9):555.

[15]Dezfouli MA,Yadegari S,Nafissi S,et al.Four novel C20orf54 mutations identified in Brown-Vialetto-Van Laere syndrome patients[J].J Hum Genet,2012,57(9):613-617.

[16]Koy A,Pillekamp F,Hoehn T,et al.Brown-Vialetto-Van laere syndrome:a riboflavin-unresponsive patient with a novel mutation in the C20orf54 gene[J].Pediatr Neurol,2012,46(6):407-409.

東莞市社會科技發展項目(2013108101052)；廣東省大學生創新創業訓練項目(2KY12023)。作者簡介：黃志剛(1971-)，副教授，博士，主要從事腫瘤流行病學研究。#并列第一作者。

·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.22.035

R735.1

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1671-8348(2016)22-3121-03

2016-02-08

2016-03-15)