HPLC法同時測定復(fù)方穿心蓮片中4種成分的含量

詹十音（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，武漢　430015）

HPLC法同時測定復(fù)方穿心蓮片中4種成分的含量

詹十音＊（湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，武漢430015）

目的：建立同時測定復(fù)方穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Phenomenex C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為225 nm（穿心蓮內(nèi)酯）、335 nm（槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、254 nm（脫水穿心蓮內(nèi)酯和山柰酚-3-O-葡萄糖苷），柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯和山柰酚-3-O-葡萄糖苷的檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.111～2.770、0.064～1.605、0.086～2.138、0.050～1.260μg（r均為0.999 9）；定量限分別為0.48、0.88、0.93、1.03 ng，檢測限分別為0.79、1.15、0.96、1.07 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.57%～100.30%（RSD=1.3%，n=9）、95.04%～98.87%（RSD=1.3%，n=9）、95.74%～102.92%（RSD=2.4%，n=9）、96.73%～100.95%（RSD=1.6%，n=9）。結(jié)論：該方法簡單靈敏、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于同時測定復(fù)方穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量。

高效液相色譜法；復(fù)方穿心蓮片；穿心蓮內(nèi)酯；槲皮素-3-O-葡萄糖苷；脫水穿心蓮內(nèi)酯；山柰酚-3-O-葡萄糖苷

復(fù)方穿心蓮片是由穿心蓮和路邊青提取制成的片劑，具有清熱解毒、涼血、利濕之功效，可用于風(fēng)熱感冒、喉痹、痄腮、濕熱泄瀉等疾病的治療［1］。穿心蓮Andrographis paniculata （Burm.f.）Nees具有清熱解毒、涼血、消腫的作用，其含有穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯等二萜內(nèi)酯類成分［2-5］。路邊青Geum aleppicum Jacq.具有益氣健脾、補(bǔ)血養(yǎng)陰、潤肺化痰的功效，含有槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、5，7，4-三羥基黃酮、山柰酚-3-O-葡萄糖苷及山柰酚等黃酮類化合物［6-9］。復(fù)方穿心蓮片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（第十九冊），該標(biāo)準(zhǔn)中除薄層鑒別外，其他均為常規(guī)檢查項，無任何專屬的定量檢測方法［1］。現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)采用薄層鑒別法進(jìn)行定性鑒別或采用高效液相色譜（HPLC）法測定穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)脂的含量［10-14］，上述檢測方法的指標(biāo)成分局限于穿心蓮藥材中的成分，未對處方中路邊青藥材的有效成分進(jìn)行定量測定，因此不能全面地控制復(fù)方穿心蓮片的質(zhì)量。為了提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜法（HPLC），建立了同時測定復(fù)方穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷含量的方法。

1　材料

1.1儀器

1260型HPLC儀，包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型二極管陣列檢測器（DAD）、G1316A型柱溫箱、G1329B型自動進(jìn)樣器、Chemstation Version B.04.02色譜工作站（美國Agilent公司）；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；BP110s型萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2藥品與試劑

復(fù)方穿心蓮片（白云山和記黃埔中藥有限公司，批號：K5S010、K5S011、K5S012、K5S013、K5S0014，規(guī)格：0.37 g/片）；穿心蓮內(nèi)酯對照品（批號：110797-201412，純度＞98.0%）、脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品（批號：110854-201406，純度＞98.0%）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷對照品（批號：111809-201306，純度＞98.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；山柰酚-3-O-葡萄糖苷對照品（南京替斯艾么中藥研究所，批號：TCM010-150624，純度＞98.0%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

穿心蓮藥材（編號：S1）和路邊青藥材（編號：S2）均購于廣東大翔藥業(yè)有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為真品。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：225 nm（穿心蓮內(nèi)酯）、335 nm（槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、254 nm（脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液取穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷對照品各適量，各分別置于25 ml量瓶中，加70%乙醇制成穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為11.08、11.08、3.21、8.55 mg/ml的單一對照品貯備液。分別量取上述單一對照品貯備液適量，制成穿心蓮內(nèi)酯110.80μg/ml、槲皮素-3-O-葡萄糖苷64.20μg/ml、脫水穿心蓮內(nèi)酯85.50μg/ml、山柰酚-3-O-葡萄糖苷50.40μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品10片，除去包衣，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，加70%乙醇20 ml，超聲提取30 min，提取2次，濾過，合并濾液，用70%乙醇定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液按復(fù)方穿心蓮片的處方比例和制備工藝，制備缺穿心蓮、路邊青的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的色譜峰與其他峰均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5，理論板數(shù)以穿心蓮內(nèi)酯峰計為10 000，保留時間為28.5 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4線性關(guān)系考察

精密稱取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10μl，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的回歸方程與線性范圍，詳見表2。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.缺路邊青的陰性對照；D.缺穿心蓮的陰性對照品；1.穿心蓮內(nèi)酯；2.槲皮素-3-O-葡萄糖苷；3.脫水穿心蓮內(nèi)酯；4.山柰酚-3-O-葡萄糖苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control without G.aleppicum；D.negative control without A.paniculata；1.andrographolide；2.quercetin-3-O-glucoside；3.dehydroandrographolide；4.kaempferol-3-O-glucoside

表2　回歸方程與線性范圍（n=6）Tab 2　Regression equations and linear ranges（n=6）

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），詳見表3。

表3　檢測限與定量限測定結(jié)果Tab 3　Determination results of detection limit and quantitation limit

2.6精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.4%、1.7%、0.82%、1.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（批號：K5S010）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.1%、1.6%，1.2%、0.86%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗

分別稱取同一批樣品（批號：K5S010）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量，詳見表4。由表4可知，本方法重復(fù)性良好。

表4　重復(fù)性試驗結(jié)果（n=6）Tab 4　Results of reproducibility test（n=6）

2.9加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：K5S010）粉末9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置于50 ml具塞錐形瓶中，分別精密加入低、中、高質(zhì)量的穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷對照品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5　加樣回收率試驗結(jié)果（n=9）Tab 5　Results of recovery test（n=9）

2.10樣品含量測定

取5批樣品粉末各3份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算各成分含量，結(jié)果見表6。

表6　樣品含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）Tab 6　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3　討論

3.1檢測波長的選擇

在考察檢測波長時，利用DAD檢測器全波長圖譜功能分別調(diào)出穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的紫外吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯的最大吸收在225 nm處，脫水穿心蓮內(nèi)酯的最大吸收為254 nm，槲皮素-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷的最大吸收峰均為335 nm，4個活性成分最大吸收波長相差較大，因此本試驗采用了變換波長進(jìn)行測定。

3.2提取溶劑的選擇

本試驗中對比了甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇作為提取溶劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用70%乙醇超聲提取2次，每次30 min，能將待測成分提取完全。

3.3流動相的選擇

筆者還分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸等流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)選用乙腈-磷酸作為流動相時，基線穩(wěn)定，樣品的峰形和分離度都較好。因此，最終選擇了甲醇-0.1%磷酸作為本試驗的流動相。

3.4樣品測定結(jié)果分析

對5批樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明各批復(fù)方穿心蓮片樣品均可檢測出穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷4種成分，但各批次樣品中上述4種成分的含量存在一定差異，可能與穿心蓮、路邊青原料來源及藥用部位、生產(chǎn)制備工藝等有關(guān)。因此，有必要對復(fù)方穿心蓮片中的有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，以保證復(fù)方穿心蓮片的療效。

綜上所述，本方法簡單靈敏、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于同時測定復(fù)方穿心蓮片中穿心蓮內(nèi)酯、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、脫水穿心蓮內(nèi)酯、山柰酚-3-O-葡萄糖苷的含量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第十九冊［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：115.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：268、350.

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Four Components in Compound Chuanxinlian Tablet by HPLC

ZHAN Shiyin（Dept.of Pharmacy，Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese&Western Medicine，Wuhan 430015，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of andrographolide，quercetin-3-O-glucoside，dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside in Compound chuanxinlian tablet.METHODS：HPLC was performed on the column of Phenomenex C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid aqueous（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 225 nm for andrographolide，335 nm for quercetin-3-O-glucoside and 254 nm for dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside，column temperature was 25℃，and the volume injection was 10μl.RESULTS：The linear range was 0.111-2.770μg for andrographolide（r=0.999 9），0.064-1.605μg for quercetin-3-O-glucoside（r= 0.999 9），0.086-2.138μg for dehydroandrographolide（r=0.999 9）and 0.050-1.260μg for kaempferol-3-O-glucoside（r=0.999 9）；the limits of quantitation were 0.48 ng，0.88 ng，0.93 ng and 1.03 ng，the limits of detection were 0.79 ng，1.15 ng，0.96 ng and 1.07 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 96.57%-100.30% （RSD=1.3%，n=9），95.04%-98.87%（RSD=1.3%，n=9），95.74%-102.92%（RSD=2.4%，n=9）and 96.73%-100.95% （RSD=1.6%，n=9），respectively.CONCLUSIONS：The method is sensitive，reliable and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of andrographolide，quercetin-3-O-glucoside，dehydroandrographolide and kaempferol-3-O-glucoside in Compound chuanxinlian tablet.

HPLC；Compound chuanxinlian tablet；Andrographolide；Quercetin-3-O-glucoside；Dehydroandrographolide；Kaempferol-3-O-glucoside

R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

1001-0408（2016）24-3425-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.35

＊主管藥師。研究方向：藥品質(zhì)量。E-mail：Zsy1835@qq.com

2016-02-29

2016-05-13）