HPLC法測定瑞戈非尼原料藥中的有關物質

滕文荃（莒縣中醫醫院，山東莒縣　276599）

HPLC法測定瑞戈非尼原料藥中的有關物質

滕文荃＊（莒縣中醫醫院，山東莒縣276599）

目的：建立測定瑞戈非尼原料藥中有關物質的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters Atlantis T3C18，流動相為0.1%三氟乙酸-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測波長為232 nm，柱溫為35℃，進樣量為10 μl。結果：AFP-PMA脲（雜質A）、FP-二甲基吡啶甲酰胺（雜質B）、3，4-雙-CTF-氨基甲酰胺基-PMA（雜質C）與主成分瑞戈非尼及其他未知雜質均能達到很好的分離；雜質A、B、C和瑞戈非尼檢測質量濃度線性范圍分別為0.511～5.108 μg/ml（r=0.999 9）、0.287～2.869 μg/ml（r= 0.999 5）、0.360～3.604 μg/ml（r=0.999 9）和1.444～14.442 μg/ml（r=0.999 8）；檢測限分別為0.052、0.022、0.084和0.071 μg/ml；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3%；雜質A、B、C加樣回收率分別為102.7%～106.3%、98.2%～102.9%、98.6%～104.3%，RSD分別為1.09%、1.83%、1.57%（n=9）。結論：該方法靈敏、快速、準確、可靠，可用于瑞戈非尼原料藥中有關物質的測定。

瑞戈非尼；高效液相色譜法；有關物質

瑞戈非尼（Regorafenib），化學名為4-［4-（｛［4-氯-3（三氟甲基）苯基］氨甲酰基｝氨基）-3-氟苯氧基］-N-甲基吡啶-2-甲酰胺一水合物，商品名為Stivarga，是由拜耳公司研制開發的一種多激酶抑制劑（MKI）［1-3］。該藥于2013年2月25日通過美國食品與藥品管理局（FDA）批準用于治療先前接受過伊馬替尼和舒尼替尼治療的局部晚期、不能手術切除或轉移性胃腸道間質瘤（GIST）患者［4-6］。目前，瑞戈非尼原料藥中的有關物質測定未見報道。筆者根據瑞戈非尼合成工藝路線及結構確證結果，確定瑞戈非尼原料藥終產品中可能存在反應副產物AFP-PMA脲（雜質A）、FP-二甲基吡啶甲酰胺（雜質B）和3，4-雙-CTF-氨基甲酰胺基-PMA（雜質C）。為更好地控制瑞戈非尼原料藥的質量，本試驗中筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對其中的有關物質進行了測定。

1　材料

1.1儀器

Waters 2695型HPLC儀，包括2489紫外-可見光檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；

1.2藥品與試劑

3-氟-4-硝基苯酚對照品（起始原料SM1，批號：20140913，純度：98.1%）、N-甲基-4-氯-2-吡啶甲酰胺對照品（起始原料SM2，批號：20140914，純度：98.6%）、3-氟-4-氨基苯酚對照品（中間體RG01，批號：RG01-0803，純度：98.4%）、4-（4-氨基-3-氟苯氧基）-N-甲基吡啶-2-甲酰胺對照品（中間體RG02，批號：RG02-0805，純度：98.8%）、雜質A對照品（批號：01-0705，純度：98.8%）、雜質B對照品（批號：01-0706，純度：97.8%）、雜質C對照品（批號：01-0707，純度：99.0%）、瑞戈非尼對照品（批號：DZ140908，純度：99.94%）、瑞戈非尼原料藥（批號：141001、141002、141003，純度：99.85%、99.76%、99.83%）均由臨沂萊博醫藥技術有限公司提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流動相：0.1%三氟乙酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：232 nm；柱溫：35℃；進樣量：10 μl。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取樣品適量，精密稱定，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并稀釋制成每1 ml中約含瑞戈非尼0.7 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2系統適用性溶液取瑞戈非尼合成工藝路線中的各起始原料、各中間體、雜質A、雜質B、雜質C和瑞戈非尼對照品各適量，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）制成一定質量濃度的混合溶液，即得。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2.3雜質混合對照品貯備液分別精密稱取雜質A對照品6.72 mg、雜質B對照品4.30 mg、雜質C對照品4.56 mg，各置于10 ml量瓶中，分別用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，分別精密量取上述3種溶液各1 ml，置于同一50 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，即得。

2.2.4瑞戈非尼對照品貯備液精密稱取瑞戈非尼對照品18.78 mg，置于25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，精密量取5 ml，置于100 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，即得。

2.3系統適用性與強制降解試驗

2.3.1系統適用性試驗取“2.2”項下供試品溶液、系統適用性溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結果表明，各起始原料、各中間體、雜質A、雜質B、雜質C與主成分瑞戈非尼峰均有較好的分離，相鄰成分峰的分離度均＞1.5，理論板數以瑞戈非尼峰計＞4 000。

圖1　系統適用性試驗高效液相色譜圖A.系統適用性溶液；B.供試品溶液；1.中間體RG01；2.起始原料SM2；3.中間體RG02；4.起始原料SM1；5.雜質A；6.雜質B；7.瑞戈非尼；8.雜質CFig 2　HPLC chromatograms of system suitability test A.system suitability solution；B.test sample solution；1.intermediate 01；2.starting material SM2；3.intermediate 02；4.starting material SM1；5/impurityA；6.impurity B；7.regorafenib；8.impurity C

2.3.2強制降解試驗 （1）酸破壞試驗：取樣品7.69 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加2 mol/L鹽酸溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置48 h，取出冷卻至室溫，加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液0.5 ml調溶液至中性，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（2）堿破壞試驗：取樣品7.38 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加2 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置24 h，取出冷卻至室溫，加入2 mol/L的鹽酸溶液0.5 ml調節溶液至中性，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（3）氧化破壞試驗：取樣品7.58 mg，置于10 ml量瓶中，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）5 ml使溶解，加30%雙氧水溶液0.5 ml，置于70℃水浴中放置3 h，取出冷卻至室溫，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。（4）光照破壞試驗：取樣品7.25 mg，置于10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，置于可見光燈（光照強度約為4 500 lx）下照射40 h。（5）高溫破壞試驗：取樣品7.93 mg，置于130℃烘箱中加熱2 h，取出放至室溫，加乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）適量溶解，轉移至10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻。分別取上述5種破壞試驗溶液各10 μl注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖2。結果表明，樣品在酸、堿、氧化、光照、高溫破壞下均有降解產物產生；雜質A在各破壞條件下均出峰，而雜質B和雜質C在有的破壞條件下未出峰；雜質A、雜質B、雜質C峰與降解產物峰和主峰均能達到較好的分離。

圖2　強制降解試驗高效液相色譜圖A.酸破壞的樣品；B.堿破壞的樣品；C.氧化破壞的樣品；D.光照破壞的樣品；E.高溫破壞的樣品；1.雜質A；2.雜質B；3.瑞戈非尼；4.雜質CFig 2　HPLC chromatograms of stress testA.sample destroyed by acid；B.sample destroyed by alkali；C.sample destroyed by oxidation；D.sample destroyed by light；E.sample destroyed by high temperature；1.impurity A；2.impurity B；3.regorafenib；4.impurity C

2.4線性關系考察

分別精密量取“2.2.3”項下雜質混合對照品貯備液1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 ml和“2.2.4”項下瑞戈非尼對照品貯備液1.0、2.0、5.0、7.0、10.0 ml，一一對應置于同一25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，作為系列線性工作溶液（1#～5#），分別精密量取10 μl注入HPLC儀，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2。

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5檢測限

取“2.2”項下雜質混合對照品貯備液和瑞戈非尼對照品貯備液各適量，逐級稀釋，制備系列質量濃度的混合溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為3時測得檢測限。結果，雜質A、B、C和瑞戈非尼的檢測限分別為0.052、0.022、0.084和0.071 μg/ml。

2.6精密度試驗

取雜質A、B、C對照品各適量，置于同一量瓶中，制成質量濃度均約為7 μg/ml的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，雜質A、B、C峰面積的RSD分別為0.97%、0.57%、0.62%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.7穩定性試驗

精密稱取樣品（批號：141001）17.76 mg，置于25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，作為供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質A、B、C和瑞戈非尼峰面積的RSD分別為2.66%、0.35%、0.58%和0.83%（n=9），說明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

2.8重復性試驗

取同一批樣品（批號：141001）適量，共6份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質A、B、C和瑞戈非尼峰面積的RSD分別為0.93%、1.02%、0.89%和0.86%（n=6），說明本方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

精密量取“2.2.3”項下雜質混合對照品貯備液1 ml，置于10 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，分別精密量取2.0、3.0、4.0 ml，各3份，分別置于含樣品（批號：141003）17.32、17.15、17.87、18.00、17.15、17.39、17.52、17.92、18.23 mg的25 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）溶解并定容，搖勻，作為低、中、高質量濃度的雜質加樣回收率試驗溶液，精密量取各10 μl，分別注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10樣品中有關物質測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液；并精密量取上述各批供試品溶液1 ml，分別置于100 ml量瓶中，用乙腈-無水甲酸（90∶10，V/V）定容，搖勻，作為對照溶液。取上述兩種溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，以自身對照法計算各有關物質的含量，結果見表4。

3　討論

3.1檢測波長的選擇

根據合成工藝中各起始原料、各中間體、雜質A、雜質B、雜質C、瑞戈非尼的紫外掃描圖譜以及樣品強制降解試驗中的降解產物的二極管陣列檢測器掃描圖譜，發現使用232 nm波長進行檢測時，可將各雜質成分有效檢出，分離度較好。故最終選擇232 nm為本試驗檢測波長。

3.2流動相的選擇

本試驗參考相關文獻［7-10］，選擇流動相A為0.1%三氟乙酸溶液、流動相B為乙腈，并對流動相系統的洗脫方式進行了考察。在等度洗脫條件下主峰相鄰雜質分離度不理想，個別雜質出峰較晚；而采用表1所示梯度洗脫程序時，主成分與各雜質均能達到有效分離，且各峰純度都達100%。故本試驗最終選擇該流動相系統和梯度洗脫程序進行洗脫。

3.3雜質A、B、C的定量

本試驗中將雜質A、B、C作為已知雜質進行研究，雜質A、B的校正因子均不在0.9～1.1范圍內，對其按照加校正因子的自身對照法定量，雜質C及未知雜質按照不加校正因子的自身對照法進行定量。

表3　加樣回收率試驗結果（n=9）Tab 3　Results of recovery test（n=9）

表4　樣品有關物質測定結果（n=3，%）Tab 4　Determination results of related substances（n=3，%）

綜上所述，本方法靈敏、快速、準確、可靠，可用于瑞戈非尼原料藥中有關物質的測定。

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［5］Grothey A，Van Cutsem E，Sobrero A，et al.Regorafenib monotherapy for previously treated metastatic colorectal cancer（CORRECT）：an international，multicentre，randomised，placebo-controlled，phase 3 trial［J］.Lancet，2013，381（9 863）：303.

［6］Pal D，De T，Baral A，et al.Regorafenib（STIVARGA）：a new option in the treatment of patients with metastatic colorectal cancer（CRC）［J］.J Pharm Pharm Sci，2013，5 （3）：6.

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［9］van Erp NP，de Wit D，Guchelaar HJ，et al.A validated assay for the simultaneous quantification of six tyrosine kinase inhibitors and two active metabolites in human serum using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，937：33.

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（編輯：周箐）

Determination of Related Substances in Regorafenib by HPLC

TENG Wenquan（Chinese Medicine Hospital In Juxian，Shandong Juxian 276599，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of related substances in regorafenib.METHODS：Gradient elution HPLC was performed on the column of Waters Atlantis T3C18with mobile phase A of 0.1%Trifluoroacetic acid solution and B of acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 232 nm and column temperature was 35℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：AFP-PMA urease（impurity A），FP-dimethyl pyridine carboxamide（impurity B），3，4-bis-CTF-aminoformamido-PMA（impurity C），regorafenib and other impurities were well separated；the linear range was 0.511-5.108 μg/ml for impurity A（r=0.999 9），0.287-2.869 μg/ml for impurity B（r=0.999 5），0.360-3.604 μg/ml for impurity C （r=0.999 9）and 1.444-14.442 μg/ml for regorafenib（r=0.999 8）；the detection limit were 0.052，0.022，0.084 and 0.071 μg/ml，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recoveries of impurity A，B and C were 102.7%-106.3%（RSD=1.09%，n=9），98.2%-102.9%（RSD=1.83%，n=9）and 98.6%-104.3%（RSD=1.57%，n=9）.CONCLUSIONS：The method is sensitive，rapid，accurate and reliable，and can be used for the determination of related substances in regorafenib.

Regorafenib；HPLC；Related substance

R927文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3431-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.37

＊主管藥師。研究方向：醫院藥學。電話：0633-6891102。E-mail：pharm_2012@126.com

2015-08-31

2016-07-13）