HPLC法同時測定蕁麻疹丸中3種有效成分的含量

雷　琪，田　蜜（重慶廣播電視大學文法學院農醫教研室，重慶　400052）

HPLC法同時測定蕁麻疹丸中3種有效成分的含量

雷琪＊，田蜜（重慶廣播電視大學文法學院農醫教研室，重慶400052）

目的：建立同時測定蕁麻疹丸中芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Alltima C18，流動相為甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V），流速為1.0 ml/min，檢測波長為230 nm（芍藥苷）、280 nm（黃芩苷）、300 nm（歐前胡素），柱溫為30℃，進樣量為10μl。結果：芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的檢測質量濃度線性范圍為5.40～54.0 μg/ml（r=0.999 8）、11.29～112.9 μg/ml（r=0.999 7）、24.95～249.5 μg/ml（r=0.999 9）；定量限分別為5.4、11.2、30.0 ng，檢測限分別為1.8、2.8、7.5 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.88%～98.33%（RSD=0.95%，n=6）、96.86%～99.96%（RSD= 1.20%，n=6）、98.07%～100.55%（RSD=0.92%，n=6）。結論：該方法簡便、準確、專屬性強、重復性好，可用于測定蕁麻疹丸中黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素的含量。

蕁麻疹丸；高效液相色譜法；芍藥苷；黃芩苷；歐前胡素；含量測定

蕁麻疹丸為衛生部頒布標準中藥成方制劑第10冊（WS3-B-1976-95）收載的中藥復方制劑，由赤芍、黃芩、白芷、防風、白鮮皮、薄荷、川芎等多味中藥材組成，具有清熱祛風、除濕止癢的功效，臨床上用于風、濕、熱而致的蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢等疾病的治療［1］。其中，黃芩有清熱燥濕、瀉火解毒的功能；赤芍具有清熱涼血、活血祛瘀的功效。黃芩苷和芍藥苷為該藥的主要活性成分，原標準尚未建立該制劑中芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的含量測定方法［2］；且目前也僅有對蕁麻疹丸中芍藥苷單獨進行含量檢測的文獻，尚未有同時測定芍藥苷和黃芩苷的研究。為了更好地控制該制劑質量，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定蕁麻疹丸芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的含量。

1　材料

1.1儀器

1200型HPLC儀，包括紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Agilent公司）；KQ-300型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；AE-240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；1852D型超純水機（重慶摩爾制水設備有限公司）。

1.2藥品與試劑

蕁麻疹丸（吉林龍泰制藥股份有限公司，批號：140204、131006、131101，規格：10 g/袋）；芍藥苷對照品（批號：110736-201336，純度：98%）、黃芩苷對照品（批號：110715-201216，純度：94%）、歐前胡素對照品（批號：110826-201310，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：230 nm（芍藥苷）、280 nm（黃芩苷）、300 nm（歐前胡素）；柱溫：30℃；進樣量：10μl。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液精密稱取芍藥苷對照品10.80 mg、黃芩苷對照品22.59 mg、歐前胡素對照品49.91 mg，分別各置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為單一對照品貯備液。精密吸取上述單一對照品貯備液各10 ml，置于20 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得芍藥苷黃芩苷、歐前胡素質量濃度分別為0.108 0、0.225 9、0.499 1 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取樣品適量，研細，取細粉約5 g，精密稱定，取樣品粉末適量，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定質量，超聲處理30 min，放至室溫，再次稱定質量，用甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液按樣品的處方工藝和配方比例制備缺芍藥、黃芩和白芷的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3系統適用性與專屬性試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞5.6，理論板數分別以芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素峰計均≥6 000，保留時間分別為11、15.8、17 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對照品；B.陰性對照；C.供試品；1.芍藥苷；2.黃芩苷；3.歐前胡素Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.negative control；C.test sample；1.paeoniflorin；2.baicalin；3.imperatorin

2.4線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品液各0、0.5、1、2.5、5 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇制成黃芩苷（質量濃度分別為0、5.40、10.80、27.0、54.0 μg/ml）、芍藥苷（質量濃度分別為0、11.29、22.58、56.45、112.9 μg/ml）、歐前胡素（質量濃度分別為0、24.95、49.9、124.75、249.5 μg/ml）系列對照品溶液。分別吸取上述系列對照品溶液各10 μl，按“2.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表1。

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ）；當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），詳見表2。

表1　回歸方程與線性范圍Tab 1　Regression equations and linear ranges

表2　定量限與檢測限Tab 2　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果，芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素峰面積的RSD分別為0.49%、0.55%、1.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7穩定性試驗

取同一供試品溶液（批號：140204）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素峰面積的RSD分別為0.95%、1.24%、1.31%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

2.8重復性試驗

取同一批樣品（批號：140204）適量，共6份，研細，精密稱定，置于50 ml量瓶中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的含量，詳見表3。由表3可知，本方法重復性良好。

表3　重復性試驗結果（n=6）Tab 3　Results of reproducibility tes（tn=6）

2.9加樣回收率試驗

取已知含量的同一批樣品（批號：140204）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再分別加入一定量的待測成分對照品適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表4。

2.10樣品含量測定

分別取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的含量，結果見表5。

3　討論

3.1檢測指標的確定

現行質量標準中蕁麻疹丸的鑒別和含量測定項，不能全面地反映該藥品的質量。2015年版《中國藥典》（一部）將黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素分別作為黃芩、赤芍和白芷藥材的質量控制指標［2］。因此，本研究選擇黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素作為蕁麻疹丸的質量控制指標，采用HPLC波長切換檢測的方法，同時對樣品中黃芩、赤芍和白芷的主要有效成分黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素進行定量分析。

表4　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab 4　Result of recovery test（n=6）

表5　樣品含量測定結果（n=3，mg/g）Tab 5　Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3.2檢測波長的選擇［3-5］

筆者將黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素的單一對照品溶液分別在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果黃芩苷在280 nm波長處有最大吸收，芍藥苷在230 nm波長處有最大吸收，歐前胡素在300 nm波長處有最大吸收。為保證各成分均有適宜的靈敏度，并減少干擾，本研究最終選擇切換波長檢測各成分。

3.3供試品溶液提取方法的選擇

在供試品溶液的制備過程中，筆者考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇等溶液作為提取溶劑，并對超聲提取時間（10、20、30、40 min）進行優選［6-7］。結果顯示，甲醇提取率最高，且超聲30 min后芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素已基本提取完全，故將樣品提取方法確定為甲醇溶解后，超聲提取30 min。

3.4流動相的選擇

有不少文獻報道了芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素含量測量的流動相［8-13］，筆者參考2015年版《中國藥典》（一部）中赤芍、黃芩和白芷項下芍藥苷、黃芩苷和歐前胡素的含量測定方法，對流動相進行了探索，比較了甲醇-水-冰醋酸（50∶19∶1，V/V/V）、甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）和乙腈-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）等多組流動相。結果顯示，甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）為流動相時，3種成分的色譜峰分離均較好，出峰時間適宜，分離度好，色譜對稱性較好。

3.5色譜柱的選擇

本試驗同時考察了4種品牌色譜柱Waters SunFireTMC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent HC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、DiamonsilTMC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果，根據圖譜的分離效果，最終選擇色譜柱Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為本試驗的色譜柱。

綜上所述，本方法簡便、準確、專屬性強、重復性好，可用于測定蕁麻疹丸中黃芩苷、芍藥苷和歐前胡素的含量。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑：第十冊［S］.北京：人民衛生出版社，1993：106.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：147.

［3］潘浪勝，呂秀陽，平東.赤芍中芍藥苷提取工藝的優化［J］.天然產物研究與開發，2006，18（2）：105.

［4］張桂英，范廣才.高效液相色譜法測定蒲公英口服液中芍藥苷的含量［J］.中國醫院藥學雜志，2006，26（1）：98.

［5］張捷，譚生建，王歡，等.高效液相色譜法測定小二潤肺止咳口服液中橙皮苷和黃芩苷的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（8）：1 454.

［6］張誠賢，徐陸忠，朱佳茜，等.高效液相色譜法測定蕁麻疹丸中黃芩苷的含量［J］.醫藥導報，2013，32（12）：1 649.

［7］張薇，朱智甲，張晗，等.液相色譜-串聯質譜法測定白芷中3種香豆素［J］.分析實驗室，2012，31（5）：104.

［8］費超，陳然，曹杰，等.HPLC法測定芩翹抗感顆粒中黃芩苷的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：63.

［9］彭其勝，穆瑤，陳歡.HPLC法測定黃芩免煎顆粒和飲片中黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2016，27（9）：1 259.

［10］張小博，曹恒濤，王小艷.黃連上清片中黃芩苷與歐前胡素的含量測定方法研究［J］.中國執業藥師，2015，12（9）：32.

［11］王連國，王欣，孟憲杰，等.高效液相色譜法測定白芷中歐前胡素和異歐前胡素含量［J］.現代中西醫結合雜志，2011，20（22）：2 816.

［12］戴紅鋒，尹慶鋒，謝彤.UPLC法測定復方虎黃噴劑中虎杖苷、黃芩苷、歐前胡素［J］.南京中醫藥大學學報，2014，30（1）：88.

［13］朱冠華，顧圣瑩，康雷，等.HPLC法同時測定參芍胃安顆粒中芍藥苷和黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2014，25 （27）：2 533.

（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Three Components in Urticaria Pill by HPLC

LEI Qi，TIAN Mi（Dept.of Agriculture and Medicine，College of Humanities and Law，Chongqing Radio and Television University，Chongqing 400052，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of paeoniflorin，baicalin and imperatorin in Urticaria pill.METHODS：HPLC was performed on the column of Alltima C18with mobile phase of methanol-water-Phosphoric acid（55∶45∶0.2，V/V/V）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 230 nm for paeoniflorin，280 nm for baicalin and 300 nm for imperatorin，column temperature was 30℃，and the volume injection was 10μl.RESULTS：The linear range was 5.40-54.0 μg/ml for paeoniflorin（r=0.999 8），11.29-112.9 μg/ml for baicalin（r=0.999 7）and 24.95-249.5 μg/ml for imperatorin （r=0.999 9），respectively；the linit of quantitation were 5.4、11.2、30.0 ng，the lirnit of detection were 1.8、2.8、7.5 ng；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.88%-98.33%（RSD=0.95%，n=6），96.86%-99.96%（RSD=1.20%，n=6）and 98.07%-100.55%（RSD=0.92%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate with strong specificity and good reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of paeoniflorin，baicalin and imperatorin in Urticaria pill.

Urticaria pill；HPLC；Paeoniflorin；Baicalin；Imperatorin；Content determination

R917文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3437-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.39

＊講師，碩士。研究方向：藥理學與藥物分析。E-mail：345746479@qq.com

2016-03-21

2016-06-06）