UPLC法同時測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量

吳蔚苗，羅錦瑩（佛山市順德區中醫院中藥房，廣東佛山　528000）

UPLC法同時測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量

吳蔚苗＊，羅錦瑩#（佛山市順德區中醫院中藥房，廣東佛山528000）

目的：建立同時測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸（梯度洗脫），流速為0.40 ml/min，檢測波長為326、220 nm，柱溫為30℃，進樣量為2 μl。結果：綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的檢測質量濃度線性范圍分別為7.67～76.67 μg/ml（r=0.999 2）、13.33～133.33 μg/ml（r=0.999 7）、13.33～133.33 μg/ml（r=0.999 8）；定量限分別為0.11、0.05、0.05 ng，檢測限分別為0.03、0.01、0.01 ng；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜3%；加樣回收率分別為96.19%～101.90%（RSD=2.19%，n=6）、95.35%～101.16%（RSD=2.27%，n=6）、95.92%～98.98%（（RSD=1.33%，n=6）。結論：該方法快速、準確，適用于同時測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。

超高速液相色譜法；吳茱萸；綠原酸；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；含量測定

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri （Dode）Huang的干燥近成熟果實，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等證［1］?，F代藥理研究發現其具有強心、保護心臟、抗心律失常、降壓、抗血栓、抗腫瘤、抗過敏和抗炎鎮痛等作用［2］。吳茱萸主要分布于秦嶺以南地區，主產于貴州、湖南、四川、廣西、云南等地［3］。隨著市場需求量的不斷增加，吳茱萸價格也隨之攀升，以致時有以次充好現象出現?，F行2015年版《中國藥典》（一部）中吳茱萸只以吳茱萸堿和吳茱萸次堿兩者總和為質量控制指標［1］；且目前多見采用高效液相色譜法（HPLC）法和超臨界流體色譜（SFC）法對吳茱萸中生物堿［4-7］、苦味素類成分測定的報道［8-12］，對吳茱萸中其他類成分研究報道較少。超高效液相色譜法（UPLC）作為一種新型液相色譜技術，相比傳統HPLC，具有分離能力強、分析速度快、靈敏度高的特點［13］。因此，筆者采用UPLC法同時快速測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，以期為吳茱萸的質量控制提供參考。

1　材料

1.1儀器

ACQUITY UPLC H-Class型UPLC儀，包括QSM四元溶劑管理器、二極管陣列（PDA）檢測器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower3色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）；“艾柯”DISCOVER-III-18型實驗室專用超純水機（成都唐氏康寧科技發展有限公司）。

1.2試劑

綠原酸對照品（批號：MUST-13081601，純度≥98.0%）、吳茱萸堿對照品（批號：MUST-13060901，純度≥98.0%，）、吳茱萸次堿對照品（批號：MUST-12031010，純度≥98.0%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3藥材

吳茱萸藥材（編號：W1-W12）購自佛山市中藥店和廣州清平藥材市場，產自廣西、湖南、貴州等省份，經佛山市順德區中醫院李正平副主任中藥師鑒定為蕓香科植物吳茱萸E/rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.40 ml/min；柱溫：30℃；進樣量：2 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液取綠原酸對照品、吳茱萸堿對照品、吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，置于同一25 ml量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，制成每1 ml含綠原酸76.67 μg、吳茱萸堿133.33 μg、吳茱萸次堿133.33 μg的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液取經充分干燥的吳茱萸粉末（過2號篩）0.2 g，精密稱定，置于50 ml具塞錐形瓶中，加80%乙醇25 ml，稱定質量，浸泡30 min，超聲提取30 min，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液取80%甲醇溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5，理論板數以綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰計分別為11 000、11 500、11 500。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1　超高效液相色譜圖A.陰性對照；B.混合對照品；C.供試品；1.綠原酸；2.吳茱萸堿；3.吳茱萸次堿Fig 1　UPLC chromatogramsA.negative control；B.mixed reference substance；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.evodiamine；3.rutecarpine

2.4線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于5 ml量瓶中，用80%甲醇定容，搖勻，制成不同質量濃度的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液2 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，詳見表2。

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得定量限（LOQ），當信噪比為3∶1時，得檢測限（LOD），詳見表3。

表3　定量限與檢測限Tab 3　Quantitation limit and detection limit

2.6精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.21%、1.48%、0.85%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.7穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.05%、1.75%、1.48%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8重復性考察

取同一批樣品（編號：W1）粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均含量分別為10.80、17.17、9.51 mg/g，RSD分別為1.89%、1.37%、2.04%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.9加樣回收率試驗

取樣品粉末（編號：W1）6份，每份約0.10 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表4。

2.10樣品含量測定

取12批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量，結果見表5。

3　討論

3.1提取溶劑的考察

筆者考察了20%、40%、60%、80%、100%乙醇對綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿提取率的影響。結果，40%乙醇作為提取溶劑時，綠原酸提取率最大；100%乙醇作為提取溶劑時，吳茱萸堿、吳茱萸次堿提取率最大；而80%乙醇作為提取溶劑時，上述3種成分提取率均較大。綜合考慮，本試驗選擇80%乙醇作為提取溶劑。

表4　加樣回收率試驗結果（n=6）Tab 4　Result of recovery test（n=6）

表5　樣品含量測定結果（n=3）Tab 5　Result of contents determination of samples（n=3）

3.2流動相的考察

筆者考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.3%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.3%磷酸作為流動相時的分離效果。結果，乙腈-0.1%磷酸作為流動相時，分離效果最好、基線平且系統壓力低。故選用乙腈-0.1%磷酸作為本研究的流動相。

3.3測定波長的選擇

筆者采用PDA檢測器，在200～400 nm波長范圍內掃描與綠原酸、吳茱萸堿和吳茱萸次堿保留時間相同的供試品色譜峰的紫外光譜，并與對照品的紫外光譜進行比較。結果，綠原酸的最大吸收波長為325.6 nm，吳茱萸堿的最大吸收波長為225.8 nm，吳茱萸次堿的最大吸收波長為215.2 nm。所以，本試驗采用波長切換技術，0～4 min波長選取326 nm，4～12 min波長選取220 nm。

3.4樣品含量測定結果分析

筆者測定了12批吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。結果，不同產地3種成分含量具有一定差異，綠原酸的含量為7.32～11.53 mg/g，吳茱萸堿的含量為7.49～19.35 mg/g，吳茱萸次堿的含量為3.19～12.68 mg/g，這可能與產地環境因素及采收時間等不同有關。

綜上所述，本方法快速、準確，適用于同時快速測定不同產地吳茱萸中綠原酸、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量。

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（編輯：劉柳）

Simultaneous Determination of Chlorogenic Acid，Evodiamine and Rutecarpine in Different Places of Evodia rutaecarpa by UPLC

WU Weimiao，LUO Jinying（Dept.of TCM，TCM Hospital of Foshan Shunde District，Guangdong Foshan 528000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，evodiamine，rutecarpine in different places of Evodia rutaecarpa.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid aqueous solution（gradient elution）at a flow rate of 0.40 ml/min，the detection wavelength was 326 nm and 220 nm，column temperature was 30℃，and the volume injection was 2 μl.RESULTS：The linear range was 7.67-76.67 μg/ml for chlorogenic acid（r=0.999 2），13.33-133.33 μg/ml for evodiamine（r=0.999 7）and 13.33-133.33 μg/ml for rutecarpine（r=0.999 8）；the limits of quantitation were 0.11 ng，0.05 ng and 0.05 ng，the limits of detection were 0.03 ng，0.01 ng and 0.01 ng，respectively；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3%；recoveries were 96.19%-101.90%（RSD=2.19%，n=6），95.35%-101.16%（RSD=2.27%，n=6）and 95.92%-98.98%（RSD=1.33%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is rapid and accurate，and suitable for the simultaneous determination of chlorogenic acid，evodiamine，rutecarpine in different places of E.rutaecarpa.

UPLC；Evodia rutaecarpa；Chlorogenic acid；Evodiamine；Rtecarpine；Content determination

R284.1文獻標志碼A

1001-0408（2016）24-3446-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.24.42

＊主管中藥師。研究方向：中藥調配。電話：0757-22626032。E-mail：13724672006@163.com

主管中藥師。研究方向：中藥調配。電話：0757-22208163。E-mail：1656377337@qq.com

2015-07-30

2016-05-20）