湖北地區炎癥因子基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系

艾志兵，　杜　玲，　李龍倜，　羅國君

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湖北地區炎癥因子基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系

艾志兵1，杜玲2，李龍倜1，羅國君2

目的探討相關炎癥因子基因多態性與中國湖北地區漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)的關系。方法在湖北漢族人群中篩選260例腦梗死患者為腦梗死組;200例健康體檢者為對照組，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFIP)方法測定炎癥因子基因多態性。結果腦梗死組與對照組比較，BRAP基因外顯子90A/G分布存在統計學差異(χ2=11.2,P<0.05)，IL-15基因的C/A基因型分布不存在組間統計學差異(χ2=3.220，P>0.05)，Logistic回歸分析提示，BRAP基因外顯子90GG等位基因攜帶者發生ACI的風險是CC等位基因的1.8倍(OR=1.476，95%CI1.142～2.268)，且該關聯獨立于性別、年齡、吸煙、高血壓等風險因素。沒有證據表明IL-15基因13687C/A位點單核苷酸多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死易感性相關。結論BRAP 90A/G外顯子基因多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死發病有關，可能是中國湖北地區漢族人群動脈粥樣硬化性腦梗死發病的遺傳易感基因。

動脈粥樣硬化性腦梗死；腦梗死基因多態性；白細胞介素-15；乳腺癌易感基因相關蛋白基因

動脈粥樣硬化是引發缺血性腦血管病的重要病理基礎。隨著對動脈粥樣硬化發生、發展研究的深入，新的觀點認為，炎癥因子基因多態性可能在動脈粥樣硬化過程中具有重要作用[1]。IL-15是一種在腦梗死早期即表達增高的前炎性因子，有研究認為IL-15含量的測定可作為早期診斷急性腦梗死腦損害程度的指標[2]。乳腺癌易感基因相關蛋白基因(BRAP)的單核苷酸多態性較為常見，而位于其外顯子90的基因多態性已被證實與動脈粥樣硬化相關[3,4]。

本研究擬通過PCR-RFLP技術，檢測湖北地區漢族人BRAP基因外顯子90A/G和IL-15基因13687C/A的多態性，旨在探討其與ACI的關系。

1　材料與方法

1.1一般資料選擇2010年5月-2012年11月在中國湖北醫藥學院附屬太和醫院就診的湖北漢族ACI住院患者，共260例，其中男146例，女114例，平均年齡(52.3±6.7)歲。所有患者均符合中國腦血管病防治指南診斷標準，經頭部CT和/或MRI確診，不包括心源性栓塞、腫瘤、血管畸形或動脈瘤等引起的腦梗死、血液病、無癥狀性腦梗死；排除腦出血等。對照組則選取200例湖北漢族健康體檢者，均經過臨床檢查或影像學檢查排除腦血管病，無腦血管病家族史，其中男108例，女92例，平均(53.4±7.5)歲。腦梗死組和對照組在年齡、體重指數、性別差異等方面無統計學意義。所有研究對象均經本院醫學倫理委員會批準,并征得所有入選對象的知情同意。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA的提取抽取外周靜脈血2 ml,置入EDTA抗凝管，采用Qiagen公司DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2PCR擴增參考相關文獻，利用NCBI設計引物，BRAP基因外顯子90A/G的引物序列如下：上游引物為5’-TCATCTCCCCCTTCCTCTGA-3’，下游引物為5’-ATCTGCCCAAGCTCCCTCTA-3’；IL-15基因13687C/A的引物如下：上游為5’-AGCTAAATGTGTGGGTGGGC-3’，下游為5’-CCAGAAGAAGGGGGAGATGA-3’。PCR引物均由上海生工合成。PCR條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個循環周期后再72 ℃延伸7 min，PCR產物4 ℃保存。

1.2.3限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析取10 μl PCR產物，經1.6%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，加MbiI限制性內切酶配置Pstl 0.6 μl的反應體系，37 ℃酶切過夜后，1.6%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析處理系統觀察電泳結果并確定基因型。所有樣本均接受重復檢驗，以驗證檢測的準確度。

1.3統計學處理用SPSS 14.0統計軟件，采用χ2檢驗和t檢驗，不同基因型導致食管癌的風險值采用單因素和多因素Logistic回歸分析計算優勢比(OR)及其95%可信區間(CI)，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1一般資料腦梗死組和對照組患者在肌酐(cr)、體重指數 (BMI)、尿素氮(BUN)、谷丙轉氨酶(ALT)等各因子水平方面無統汁學差異(P>0.05)；腦梗死組的甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBS)及高密度脂蛋白(HDL-C)等指標高于對照組，但差異不具有統計學意義(P>0.05)；腦梗死組低密度脂蛋白(L-DLC)、C反應蛋白(CRP)、總膽固醇(TC)、高血壓病史、冠心病史、糖尿病史高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)則低于對照組，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2基因多態性分析BRAP基因和IL-15基因PCR產物均為特異條帶，無雜帶。BRAP基因PCR產物經MbiI限制性內切酶酶切后，呈現3種基因型：CC純合子型(含163 bp 1條片段);CG雜合子型(含163 bp，101 bp，62 bp 3條片段);GG純合子型(含101 bp，62 bp 2條片段)。IL-15基因PCR產物經SphI限制性內切酶切后，呈現3種基因型：AA純合子型(含284 bp 1條片段);CA雜合子犁(含284 bp，166 bp，118 bp 3條片段);CC純合子型(含166 bp，118 bp 2條片段)。

2.3基因多態性分布分析ACI組及對照組基因型和等位基因頻率分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(P>0.05)。BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組及對照組人群中的分布差異有顯著性(χ2=11.2，P<0.05)，等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在明顯差異(χ2=8.52，P<0.05)。經等位基因頻率的相對風險分析發現，GG等位基因攜帶者發生ACI的風險是CC等位基因的1.8倍(OR=1.476，95%CI1.142～2.268)。IL-15 13687C/A等位基因及基因型在病例組和對照組間的差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1　炎癥因子基因各多態性位點等位基因和基因型頻率的分布

與對照組人群相比BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組分布差異有顯著性(χ2=11.2，P<0.05);與對照組人群IL-15 13687C/A等位基因及基因型與ACI組比較的差異無統計學意義P>0.05

3　討　論

隨著社會發展腦梗死的發病率明顯升高，已成為高發病之一，其基本病因是動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化的早期病變表現為內膜脂質、復合碳水化合物和血液成分的灶狀沉積、平滑肌細胞增生和膠原纖維增多導致脂紋形成等[5]。不同類型的腦梗死患者動脈粥樣硬化有不同的特點，國外研究表明，動脈粥樣硬化始于血管內皮細胞受損，粥樣硬化斑塊的形成是管壁對于各種損傷因子刺激作出的“炎性-增殖”應答，炎性因子參與這一過程的始終[6]。但國內有關這一方面的研究還比較少見。在該項研究中，我們參照既往文獻，對可能的動脈粥樣硬化性腦梗死造成影響的炎癥因子的多態性進行了探索。

IL-15是一種細胞因子，其生物學活性主要有促進T細胞、NK細胞的激活、刺激Th1細胞克隆的增殖與活化等[7]，有文獻表明，IL-15與血管內皮受損修復密切相關[6]。已經證明，IL-15基因的13687C/A多態性與高血壓、冠心病等多種疾病相關[5]。BRAP最初被證實為一種細胞質蛋白,其作用是識別乳腺癌易感基因的信號肽。隨著進一步的研究發現其可能是半乳凝素2的結合對象[5]?？赏ㄟ^調整Ras激酶抑制劑(KSR)的結構活性來調整促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的信號，而激酶信號途徑具有調節細胞存活生長、分化、增殖及促進分泌多種炎癥因子的作用。2009年，Ozaki等人[6]進行的一項全基因組關聯性研究發現，BRAP270 T/C與心肌梗死風險相關，而Hinohara等[8]則進一步證實該基因多態性與日本和韓國人群動脈粥樣硬化易感性相關，從而使BRAP基因多態性與動脈粥樣硬化腦梗死風險之間的關聯受到了廣泛關注。

不同的種族和地區之間，各炎癥因子基因多態性基因型和等位基因頻率分布情況存在較大差異[6]，這是我們開展該項研究的主要原因。我們的研究發現中國湖北地區漢族人群ACI組與對照組患者相比，BRAP 90A/G等位基因頻率及基因型分布均有顯著性組間差異，BRAP基因外顯子90A/G基因型在ACI組及對照組人群中的分布差異有顯著性(χ2=11.1，P<0.05)，等位基因頻率在兩組人群中的分布也存在明顯差異(χ2=8.57，P<0.05)，經等位基因頻率的相對風險分析發現，G等位基因攜帶者發生ACI的風險是C等位基因的1.8倍(OR=1.472，95%CI1.144～2.267)，提示G等位基因可能是ACI的遺傳易感基因。IL-15 13687C/A等位基因頻率及基因型分布在病例組和對照組間的差異無統計學意義(P>0.05)，A等位基因攜帶者發生ACI的風險與C等位基因攜帶者也無顯著性差異(P>0.05)，提示A等位基因不是ACI的遺傳風險因素。

BRAP促發動脈粥樣硬化的機制尚未完全明確。我們的研究結果顯示BRAP 90A/G多態性位點處于強烈的連鎖不平衡狀態中，這與Ozaki等人[9]的研究結果一致。這一SNPs位點并未導致蛋白質結構中氨基酸序列的變化，然而，既往研究顯示，BRAP 90A/G導致了BRAP轉錄水平的差異，而BRAP表達水平的變化可能影響到動脈粥樣硬化腦梗死相關信號通路[10,11]。

我們的研究初步顯示，BRAP 90A/G基因多態性是中國湖北地區漢族人群的動脈粥樣硬化性腦梗死易感因素，而IL-15 13687C/A基因多態性則與動脈粥樣硬化性腦梗死易感性無相關。動脈粥樣硬化性腦梗死發病機制復雜，而BRAP 90A/G基因多態性等遺傳學標記物檢測的鑒別可能為動脈粥樣硬化性腦梗死人群的篩查、疾病的預防和治療提供新的臨床線索。

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The observation of the relationship between polymorphisms of inflammatory factors and susceptibility of atherosclerotic cerebral infarctionin a Han population in Hubei province

AIZhibing,DULing,LILongti,etal.

(DepartmentofNeurology，TaiheHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between polymorphisms of inflammatory factors and susceptibility of atherosclerotic cerebral infarction (ACI) in a Han population in Hubei province.Methods260 patients were assigned to the ACI group,the other 200 normal patients were assigned to the control group.Then the distributions of allele and genotype frequencies of inflammatory factors were detected by polymerase chain reactionk-restriction fragment length polymorphism.ResultsWe found significant difference in genotype of 90A/G polymorphism of BRAP gene (χ2=11.2,P<0.05) and no difference in genotype of 13687C/A polymorphism of IL-15 gene (χ2=3.220,P>0.05) between ACI patients and controls;Compared with BRAP gene exon 90 CC carrier,90 GG genotypes had a significantly increased ACI risk by Logistic regression analysis(OR=1.476，95%CI1.142～2.268),this association was still significant after adjustment for the sex,age,smoke,hypertension.No evidence of association was found for IL-15 gene 13687C/A polymorphisms.ConclusionThe 90 A/G polymorphism in the BRAP gene may be associated with increased risk one of the predisposing genes of ACI and among Hubei province Chinese Han population.

ACI;Single nucleotide polymorphism;IL-15；BRAP

1003-2754(2016)08-0693-03

2016-04-12；

2016-05-29

(1.湖北省十堰市太和醫院神經內科，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000;2.上海交通大學附屬第六人民醫院金山分院神經科,上海 201500)

羅國君，E-mail：junlgsy@163.com

R743.1

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