從“腦心同病”探討急性腦缺血引發心肌損傷的動態變化

劉雪梅　陶冶　傅晨　王鳳麗　鄭宏　張允嶺

?

·論著·

從“腦心同病”探討急性腦缺血引發心肌損傷的動態變化

劉雪梅陶冶傅晨王鳳麗鄭宏張允嶺

目的觀察腦缺血不同時間引發心肌損傷的變化，明確“腦心同病”的生物學基礎。方法電凝法致大腦中動脈閉塞建立急性腦缺血誘發心肌損傷大鼠模型，隨機分為正常組、假手術組、缺血6小時模型組、缺血12小時模型組和缺血24小時模型組，每組9只，記錄心電圖分析心率變異性，ELISA法測定血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)活性、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)含量，HE染色法觀察腦、心組織形態學變化，HBFP染色法觀察心肌纖維形態學變化。結果急性腦缺血明顯降低中頻段、高頻段、總頻段，中頻段與高頻段比值隨缺血時間延長呈逐漸上升趨勢；隨腦缺血時間延長，CK-MB、CTnI呈現先升高后降低趨勢，在缺血6小時達高峰；腦缺血6小時出現神經細胞腫脹、結構不清，部分胞核縮小并深染等缺血改變，隨腦缺血時間延長逐漸加重，至腦缺血24小時神經細胞數目明顯減少，結構形態破壞嚴重。心肌細胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性變；腦缺血6小時心肌纖維廣泛、彌漫親復紅染色，心肌發生早期病變，隨腦缺血時間延長心肌病變逐漸縮小、程度減輕。結論急性腦缺血能夠引發心肌損傷，心肌發生早期病變，心肌酶譜發生異常，可增加心肌酶活性、cTnI含量，在腦缺血6小時達到高峰，證實了腦心同病的生物學基礎。

急性腦缺血；心肌損傷；腦心同病

在中老年人群中，腦、心缺血性疾病普遍存在，且往往同時或先后發生而集于一身，可稱之為腦心同病。目前臨床發現缺血性腦卒中伴發無癥狀冠心病的患者比率高達16.7%[1]；急性心梗并發腦卒中的發病率從1.0%～8.6%不等[2]，可見腦心同病在臨床是較為常見的現象，在治療上常采取相同的治療方法，達到了良好的治療效果。研究發現心腦血管疾病發病部位雖然不同，但有著諸多相同的危險因素或相似的發病機制。本研究采用電凝致大腦中動脈閉塞方法,建立急性腦缺血大鼠模型，在此基礎上動態檢測血清心肌酶活性，觀察心率變異性及心肌細胞、纖維病理形態學改變，以證實急性腦缺血對心肌的損傷作用，明確腦心同病的發病機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠45只，體質量(220±20) g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要試劑、儀器。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)購自FLUKA;CK-MB、cTnI試劑盒購自RB公司。

電凝器(AESCULAP tb50)、雙極電凝鑷(TIMESCO)、自動脫水機及石蠟包埋機、切片機(LEICA)、正置顯微鏡(OLYMPUS)、多導電生理記錄儀(Biopac Systems)、酶標儀(Bio-Teck ELx800)。

1.3動物分組及局灶性腦缺血模型造模方法

實驗大鼠隨機分為正常組、假手術組、缺血6小時模型組、缺血12小時模型組、缺血24小時模型組，共5組,每組9只。手術前12小時禁食、不禁水。

參照Tamura方法[3]并做相應改進，開顱電凝大鼠大腦中動脈，制備局灶性急性腦缺血模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，左側臥位固定大鼠于手術臺，右顳入路，沿顴弓下緣做一1.5 cm長的皮膚切口，鈍性分離顳肌，切除少許下頜骨冠突，暴露鱗狀骨、上頜骨，小骨鉆鉆孔，打開2×4 mm2骨窗，劃開硬腦膜，清晰暴露右側大腦中動脈近側段。電凝嗅束與大腦下靜脈之間的大腦中動脈主干近側段，造成供血相關區梗塞灶，記錄梗塞開始時間。假手術組除不電凝大腦中動脈外，其他操作與模型組相同。

1.4觀測指標

1.4.1心率變異性分析各組大鼠在各時間點麻醉，大鼠右上、左下、右下肢皮下分別插入與MP100生理儀相連的不銹鋼針形電極，記錄心電圖信號。連續記錄ECG信號120秒，獲取低頻段(low frequency band，LF，0.04～0.20 Hz)、中頻段(midium frequency band，MF，0.21～0.60 Hz)、高頻段(high frequency band，HF，0.61～3.00 Hz)、總功率(total power，TP，0.04～3.00 Hz)，并計算中頻段與高頻段比值(MF/HF)。

1.4.2血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)活性、肌鈣蛋白I(cardiac troponinI, cTnI)含量測定各組大鼠腹主動脈取血，4℃ 3500 rpm離心10分鐘取上清。采用ELISA法，按試劑盒說明書進行操作。

1.4.3腦組織形態學觀察各組大鼠心臟灌注固定后取出大腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中進行固定。常規酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm厚度的石蠟切片。切片進行二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，0.5%伊紅復染，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察大腦皮層缺血區及其周圍組織病理形態學變化。

1.4.4心肌組織形態學觀察各組大鼠麻醉后快速摘取心臟，置于4%多聚甲醛中固定。心肌組織脫水、包埋、HE染色方法同上。光鏡下觀察心肌組織的病理學變化。

1.4.5心肌纖維形態學觀察心肌組織固定、脫水、包埋及切片等步驟同HE染色。常規脫蠟水化處理后，明礬蘇木素染色，流水沖洗返藍，0.1%堿性復紅染色，純丙酮脫水，0.1%苦味酸丙酮分化，純丙酮脫水，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察心肌組織的病理學變化。

表1　大鼠心率變異性變化

注： 與假手術組比較，aP<0.01。

1.5統計學處理

2　結果

2.1腦缺血不同時間對心率變異性分析

假手術組與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，腦缺血6小時、12小時、24小時模型組MF、HF、TF均明顯下降(P<0.01)，缺血各組之間差異無統計學意義。LF、MF/HF值各組間差異無統計學意義(P>0.05)，但隨腦缺血時間延長MF/HF比值存在逐漸上升趨勢。見表1。

2.2腦缺血不同時間對CK-MB活性和cTnI含量變化

CK-MB活性變化：假手術組與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，腦缺血6小時模型組CK-MB活性明顯增強(P<0.01)；腦缺血12小時模型組較缺血6小時模型組CK-MB活性有所降低，但仍高于假手術組(P<0.01)；腦缺血24小時模型組CK-MB活性接近假手術組基礎值水平，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　大鼠血清CK-MB活性、cTnI含量變化

注： 與假手術組比較，aP<0.01。

cTnI含量變化：假手術組與正常組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與假手術組相比，腦缺血6小時模型組cTnI含量明顯升高(P<0.01)；腦缺血12小時、24小時模型組cTnI含量接近假手術組水平，與假手術組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3腦缺血不同時間對神經細胞形態學變化

正常及假手術組：神經細胞數目多，形態結構清楚，胞漿豐富，胞核呈藍色，核仁清晰可見；腦缺血6小時、12小時、24小時模型組的神經細胞均可見不同程度的腫脹，細胞間隙增寬，出現細胞水腫現象，缺血12小時出現神經細胞數目減少，核仁消失，至缺血24小時時神經細胞形態結構顯著破壞，脫失嚴重，核固縮，核仁不可見。見圖1。

A.假手術組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖1腦缺血不同時間大鼠腦組織形態學改變(HE染色，×200)

2.4腦缺血不同時間對心肌細胞形態學變化

正常及假手術組：心肌細胞形態正常，肌原纖維排列有序，染色鮮艷均一，腦缺血6小時、12小時、24小時模型組的細胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性改變，小部分心肌細胞胞核輕微固縮，出現凝固性壞死；可見收縮帶、波狀纖維。缺血24小時較缺血6小時、12小時胞漿著色不均范圍減少。見圖2。

2.5腦缺血不同時間對心肌纖維形態學變化

正常組及假手術組心肌纖維呈金黃色，心肌細胞胞核呈藍色，心肌細胞間質中紅色點狀顆粒為紅細胞；腦缺血6小時、12小時、24小時模型組均可見心肌纖維親復紅染色呈不同程度紅色，其中缺血6小時心肌纖維親復紅染色廣泛、彌漫分布，色深紅，提示大量的心肌組織發生了早期病理改變；隨著腦缺血時間延長，心肌纖維親復紅染色逐漸變淡，提示早期病變的心肌組織隨著腦缺血時間延長而開始部分恢復。見圖3。

A.假手術組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖2腦缺血不同時間心肌組織形態學改變(HE染色，×200)

A.假手術組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖3腦缺血不同時間心肌組織形態學改變(HBFP染色，×200)

3　討論

心率變異性(heart rate variability，HRV)是指竇性心律在一定時間內周期性改變的現象，可定量評估心臟交感神經、迷走神經的張力以及兩者的均衡性對心血管活動的影響[4]，其降低可作為心律失常和心源性猝死的獨立預報指標[5-6]。HRV由LF、MF和HF三個譜峰組成，MF受心臟交感與副交感神經活動的雙重影響；HF是檢測心臟副交感神經活性的定量指標；MF/HF比值反映心臟交感和副交感神經活動的平衡。本實驗結果顯示，腦缺血后6～24小時MF、HF波段功率明顯降低，且隨缺血時間延長下降愈明顯，說明交感、副交感神經功能受損。隨腦缺血時間延長植物神經功能受損越嚴重，心臟可能因此發生繼發性損傷。既往臨床、實驗研究也證實大腦中動脈阻塞患者表現出MF、HF降低，MF/HF比值升高的現象[7-8]。

肌鈣蛋白是心肌損傷的特異性和敏感性指標[9]，具有高度的心肌特異性；肌酸激酶同工酶為心肌特異性酶，在評判心肌損傷上有較好的靈敏度。本研究采用cTnI與CK-MB聯合評價心肌的損傷程度，結果顯示腦缺血早期心肌酶活性增強，說明在腦缺血超早期心肌損傷已明確存在。在形態學上同時發現腦缺血后心肌細胞出現間質水腫，心肌纖維受損。提示腦缺血早期容易造成心肌損傷，隨著腦缺血時間延長心肌病變減輕。這與文獻報道亦一致，急性腦卒中后肌鈣蛋白水平增加并有心肌缺血的心電圖改變，而且增加死亡危險性，其機制可能與血液循環中兒茶酚胺水平增加有關[10]。

課題組認為腦、心缺血性疾病的直接病變部位是絡脈。中風、胸痹或因年老體衰，或因久病氣血虧損，腦絡、心絡失養；瘀血或痰飲內停，而致腦絡、心絡阻滯不通；情志、瘀血或痰飲郁而化火，進一步損傷腦絡、心絡，腦絡損傷發為中風，心絡損傷發為胸痹[11]。本實驗發現急性腦缺血大鼠出現不同程度的神經功能缺損癥狀，梗死周圍區神經細胞水腫、胞漿稀疏淡染，胞核固縮；心肌組織出現缺血缺氧早期病變，心肌酶譜異常，證實了腦絡損傷進而損傷心絡。腦絡損傷，腦功能受損、形質敗壞，局部正氣愈虛、邪氣愈盛，熾盛之邪以絡脈網絡為通道橫竄心絡，引起心功能損傷、甚至結構變化。腦、心損傷皆以絡脈損傷為起始，以功能、結構改變為終點結局，病絡機制是腦心同病的共性機制，急性腦缺血誘發心肌損傷的發生發展、相互影響的時空動態過程體現了病絡機制的演變規律和腦心同病的發病機制。

[1]Truelsen T，Gronbaek M，Schnohr P，et al．Stroke case fatality in Denmark from 1977 to 1992：the Copenhagen City Heart Study[J]．Neuroepidemiology，2002，21(1)：22-27．

[2]Komrad MS，Coffey CE，Coffey KS，et al．Myocardhial infarction and stroke[J]．Neurology，1984，34(11)：1403-1409．

[3]Tamura A，Graham DI，Culloch J， et al．Focal cerebral ischemia in the rat description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion[J]．Cereb Blood Flow Metab，1981，1(1)：53-60．

[4]Ramadoss M, Ramanathan G, Subbiah AJ, et al. Heart Rate Changes in Electroacupuncture Treated Polycystic Ovary in Rats[J]. J Clin Diagn Res, 2016, 10(3):1-3.

[5]Deng X, Feng X, Li S, et al. Influence of the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) on heart rate variability (HRV) in rathearts via electronic lesion[J]. Biomed Mater Eng, 2015, 26 (S1):487-495.

[6]Haddadian Z, Eftekhari G, Mazloom R, et al. Effect of endotoxin on heart rate dynamics in rats with cirrhosis[J]. Auton Neurosci, 2013 ,177(2):104-113.

[7]蔡紫峰，雷霆，金英雄，等．大鼠局灶性腦缺血對自主神經系統的影響[J]．天津醫藥，2006，34(2)：101-104．

[8]洪少勇，雷奕祺，袁明遠．缺血性腦卒中患者心率變異性及左室射血分數對照研究[J]．武警醫學，2008，19(1)：69-70．

[9]He H, Zhao ZH, Han FS, et al.Overexpression of protein kinase C ε improves retention and survival of transplanted mesenchymal stem cells in rat acute myocardial infarction[J]. Cell Death Dis， 2016 , 7(1):2056.

[10]劉元生.急性腦卒中的臨床表現[J].臨床心電學雜志，2014，23(4)：241-249.

[11]婁金麗,張允嶺,路廣林,等.心腦相關理論初探[J].北京中醫藥大學學報, 2008, 31(11):727-729.

(本文編輯： 禹佳)

Dynamic change from the “Naoxin Tongbing” on myocardial injury induced by acute cerebral ischemia

LIUXue-mei,TAOYe,FUChen,etal.

DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

Correspondingauthor:ZHANGYun-ling,E-mail：yunlingzhang2004@163.com

ObjectiveTo observe the dynamic change of myocardial injury induced by cerebral ischemia, and determine the biological basis of “Naoxin Tongbing”. MethodsRat model of middle cerebral artery occlusion was established by electro-coagulation technique. Rats were randomly divided into five groups: normal group, sham group, ischemia 6 h, 12 h, 24 h model groups. Heart rate variability was recorded by ECG; Creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) activity, cardiac troponinI(cTnI) content was detected by ELISA; Morphological changes of cerebral tissue was observed by HE staining and HBFP staining. ResultsAcute cerebral ischemia could decrease MF, HF and TF, MF/HF has an increased tendency. Serum CK-MB activity and cTnI content was increased at first and then decreased，which peaked at 6 h of ischemia. HE staining in the cerebral tissues showed the phenomena of disorganization，neurons edema, quantity decreased and nuclear condensation. The cardiac tissue of HE staining showed chromatosis light, mild coagulation necrosis; 6 hours after cerebral ischemia, myocardial fibers were extensive and diffuse, and the early pathological changes were gradually reduced, and the extent of myocardial lesions decreased with the time of ischemia. ConclusionAcute cerebral ischemia could cause myocardial injury and lead to early myocardial change, increased serum CK-MB activity and cTnI content, which peaked at 6h of cerebral ischemia. It was confirmed the biological basis of “Naoxin Tongbing”.

Acute cerebral ischemia；Cardiac injury；Naoxin Tongbing

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2012CB518406);國家國際科技合作專項(2015DFA31130)；國家自然科學基金(81173233)

100078北京中醫藥大學東方醫院實驗中心[劉雪梅、陶冶、傅晨、王鳳麗、鄭宏、張允嶺]

劉雪梅(1979- )，女，博士，副研究員。研究方向：中西醫結合腦病基礎研究。E-mail：liuxuemei04@126.com

張允嶺(1963- )，博士，教授，博士生導師。研究方向：中醫腦病臨床與機制研究。E-mail:yunlingzhang2004@163.com

R542.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.004

2016-05-10)